树脂法从发酵液中分离提取必特螺旋霉素的研究

佟泽勇

摘 要：本文采用大孔吸附富树脂柱层析结合HPLC在线检测，对树脂法从发酵液中分离提取必特螺旋霉素进行研究。最佳工艺为： 将处理好的树脂装入的树脂柱中，以流速3 BV/h上样， 静止120分钟，采用蒸馏水洗拖至无色，然后用5倍树脂床体积的磷酸盐缓冲液（PH6.8）以3 BV/h流速洗脱，收集洗脱液。本工艺稳定、可行、收率高。

关键词：必特螺旋霉素；工艺；研究

必特螺旋霉素是由发酵得到的新型抗生素[1-4]。大孔树脂法marroporr}s irm exci-}ang} purification method一种净化污溶剂的方法，具有设备简单、操作方便、节省能源、成本低、产品纯度高、不吸潮等优点[5]。发酵液指的是液体培养基接人微生物菌种，经过培养合成菌体及分泌产物，这种经微生物代谢后的液体叫发酵液。本文采用大孔吸附富树脂柱层析结合HPLC在线检测，对树脂法从必特螺旋霉素发酵液中分离提取必特螺旋霉素进行研究。

1仪器与试药

电子天平FA1004型（南京华欣分析仪器制造有限公司）；600220液相保护柱（天津琛航科苑科技发展有限公司）； UV-5500（PC）扫描型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司） ；Prominence LC-20A高效液相色谱仪（西安禾普生物科技有限公司）；兰博OV3000大容量柱温箱（天津市兰博实验仪器设备有限公司）；PRO-E-UP-100超纯水机（上海砾鼎水处理设备有限公司）；TN-120超声波清洗机（常州金坛泰纳仪器厂）；HH-W420 电热恒温三用水箱（常州翔天实验仪器厂）。乙腈（沧州鑫安化工产品有限公司）、乙酸铵 （沧州鑫安化工产品有限公司）、甲醇（天津市彪仕奇科技发展有限公司）、醋酸铵（南京化学试剂股份有限公司）、醋酸（沧州鑫安化工产品有限公司）、磷酸（南京化学试剂股份有限公司）、三乙胺（沧州鑫安化工产品有限公司）、磷酸二氢铵（沧州鑫安化工产品有限公司）。必特螺旋霉素对照品（自制）。LX-16（郑州勤实科技有限公司）、X-5型大孔吸附树脂（河北耀阳精细化工有限公司）、AB-8型大孔吸附树脂（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）、 LX-1600（郑州勤实科技有限公司）、LX-67（郑州勤实科技有限公司）、D101型大孔吸附树脂（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）、HPD400型大孔吸附树脂（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）。

2大孔吸附树脂预处理

取树脂加水使其溶胀，除去悬浮于水溶液面上的树脂颗粒，用乙醇浸泡过夜。上柱，用5倍柱体积乙醇过树脂层，直至流出液加2倍水混合后不呈白色浑浊为止，最后用水洗涤除尽乙醇备用。

3测定方法确定

分别考察5%磷酸氢二钠溶液-甲醇（60∶40），甲醇-乙腈-0.1mol/L醋酸铵溶液（30：30：40），乙腈-0.03mol·L-1醋酸铵溶液20：80），0.1mol.L-1磷酸二氢铵溶液（三乙胺调节pH6.5）-乙腈（75∶25）不同比例的流动相，结果以5%磷酸氢二钠溶液-甲醇（60∶40）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用5%磷酸氢二钠溶液-甲醇（60∶40）为流动相。

依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[6-7]。流动相：5%磷酸氢二钠溶液-甲醇（60∶40）为流动相，检测波长：231nm，流速：1.0m·min-1。

4树脂的动态吸附和洗脱实验

考察不同上样浓度、流速对树脂吸附性能的影响，确定最佳的吸附工艺条件。

4.1上样液浓度对吸附效果的影响

将必特螺旋霉素发酵液分别处理成效价至1.0mg/mL﹑1.2mg/mL﹑1.4mg/mL﹑1.6mg/mL上样，进行动态吸附实验。实验表明，效价为1.2mg/mL时吸附效果最好。将1.2mg/mL浓度的样品分别上样0.5﹑0.7﹑0.3倍柱体积，结果表明上样量为0.3倍柱体积为最佳。分别采用1BV/h、2 BV/h、3 BV/h的流速上样，结果表明采用2 BV/h和3 BV/h流速上样优与1BV/h，2 BV/h和3 BV/h的流速无明显差异，所以采用3 BV/h的流速上样。

4.2洗脱剂乙醇浓度对必特螺旋霉素解吸效果的影响

将效价为1.2mg/mL提取液上柱， 静止30分钟，用蒸馏水冲洗至无色。分别采用40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、磷酸鹽缓冲液（PH6.5）、磷酸盐缓冲液（PH6.6）、磷酸盐缓冲液（PH6.8）、磷酸盐缓冲液（PH7.0）、磷酸盐缓冲液（PH7.2）、磷酸盐缓冲液（PH7.4），以3 BV/h流速进行洗脱，实验表明磷酸盐缓冲液（PH6.8）的洗脱效果最好。将效价为1.2mg/mL提取液上柱，用蒸馏水冲洗至无色。分别采用4倍柱体积、5倍柱体积、6倍柱体积、7倍柱体积磷酸盐缓冲液（PH6.8）以3 BV/h流速洗脱，结果表明5倍柱体积、6倍柱体积、7倍柱体积含量相同，所以采用5倍柱体积磷酸盐缓冲液（PH6.8）洗脱。

4.3最佳吸附-洗脱条件下的验证实验

将处理好的树脂装入的树脂柱中，以流速3 BV/h上样， 静止120分钟，采用蒸馏水洗拖至无色，然后用5倍树脂床体积的磷酸盐缓冲液（PH6.8）以3 BV/h流速洗脱，收集洗脱液。将洗脱液减压浓缩，使用高效液相色谱法进行含量测定。

参考文献：

[1]周建，王军峰，郝玉有，王永红，涂国全，郭美锦.基于必特螺旋霉素发酵过程物理和生理作用的消泡剂筛选[J].江西农业大学学报.2008年03期

[2]戴剑漉，王永红，刘玉伟，肖慈英，佟祖佲，储炬，张嗣良，律光耀，王以光.必特螺旋霉素基因工程菌发酵参数的研究[J].中国抗生素杂志.2005年06期

[3]周建，王军峰，吴春海，郝玉有，王永红，郭美锦.剪切力对必特螺旋霉素发酵的影响[J].食品与药品；2008年01期

[4]戴剑漉，王永红，刘玉伟，肖慈英，佟祖佲，储炬，张嗣良，律光耀，王以光.必特螺旋霉素基因工程菌发酵参数的研究[J].中国抗生素杂志. 2005（06）

[5]张嗣良.发酵过程多水平问题及其生物反应器装置技术研究——基于过程参数相关的发酵过程优化与放大技术[A].中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C].2001年

[6]唐云彪，武毅，王英武，史向国，胡立钢，顾景凯.液相色谱-串联质谱法测定人体血浆和尿液中必特螺旋霉素时的基质效应[A].中国有机质谱学第十二届全国学术大会论文集[C].2003年

[7]史向国，胡立刚，藤国生，白旭，顾景凯，钟大放.LC-MS/MS法在必特螺旋霉素Ⅰ期临床研究中的应用[A].中国有机质谱学第十二届全国学术大会论文集[C].2003年