CRP基因多态性与缺血性脑卒中和血清CRP的关联研究

赵中垚，刘迪，孙琦，王友信

脑卒中的发病率有逐年上升的趋势，由于其较高的致残率和致死率，脑卒中已成为全球性的公共卫生问题。根据2013年的全球疾病负担显示，脑卒中已成为我国疾病负担最为严重的疾病[1]。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性，而缺血性脑卒中约占到总卒中患者的80%[2]。C-反应蛋白（CRP）做为一种急性反应蛋白，是脑卒中研究当中的一种重要的生物标志物[3]。有研究表明，CRP可以通过促进对单核巨噬细胞及内皮细胞[4]等的炎症反应，从而导致动脉粥样硬化。然而另有研究表明，CRP并未参与缺血性脑卒中的发生发展[5,6]。因此，CRP在脑卒中的发病机制中的作用尚不明确，有研究表明CRP的基因多态性与CRP水平的个体差异有关，本研究分析了CRP基因多态性对缺血性脑卒中及CRP浓度的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2010年1月～2012年12月，于北京天坛医院就诊诊断为缺血性脑卒中患者共378例，其中男性284例，女性94例，年龄20～86（55±11）岁，同期健康体检人群613例为对照组，其中男性197例，女性416例，年龄27～68（47±5）岁。入组患者诊断均符合世界卫生组织（WHO）诊断标准，经头颅CT或MRI证实。排除标准：排除感染性疾病、肿瘤、免疫缺陷、缺血性心脏病、心肌病、肝肾功能不全、其他脑血管疾病等。

1.2 标本采集所有患者入院后首先搜集一般临床病史资料。患者入院24 h内抽取静脉血液样本化验相关生化指标，包括：空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC） 、高密度胆固醇脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其CRP水平，使用美国R&D Human CRP DuoSet试剂盒。

1.3 CRP基因分型从Ensembl在线数据库（http://www.ensembl.org）入选了5个与CRP相关的SNP（rs1130864，rs1205，rs2794521，rs3093059，rs876537），入选标准为最小等位基因频率＞0.05，且r2＞0.8。选择全自动DNA提取仪提取外周血白细胞基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度与纯度，通过多重PCR技术、iPLEX单碱基延伸技术和MALDI-TOF技术进行CRP基因多态性的基因分型。5 μl的反应体系包括：dddH2O 1.8Μl，10×buffer 0.5 μl，mg2+0.4 μl, dNTP 0.1 μl，Hotstar 0.2 μl，上下游引物1 μl，DNA模板1 μl。PCR扩增反应扩增程序：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共45个循环，最后72℃延伸5 min，4℃保存待用。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0软件分析数据。大部分计量数据呈正态分布，CRP呈偏态分布，统计分析使用CRP对数转换log-CRP，使用计量数据采用均数±标准差表示，两组之间CRP基因型的比较使用卡方检验，不同基因型血清CRP的浓度的比较使用单因素的方差分析，以Logistic回归模型评价CRP在缺血性脑卒中的影响，分别得出比值比（OR）与95%置信区间（95%CI）。

2 结果

2.1 一般项目及生化指标测定缺血性脑卒中患者中男性多于女性，有着较高的体质指数和血压。两组患者FPG、TC、HDL-C、LDL-C、CRP比较差异均存在统计学差异（P＜0.01）（表1）。

2.2 两组CRP基因型的比较对照组中5个SNP的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。其中rs1130864中AA基因型在两组中均少见，且IS组内AG基因型和A等位基因频率显著高于对照组（P＜0.01），而rs2794521中TC基因型在IS组中更为常见，但是C等位基因频率在两组没有显著性差异（表2～3）。

2.3 CRP基因型与血清CRP浓度的关系在对照组中，5个SNP中有3个SNP（rs876537，rs1205，rs3093059）与血清CRP浓度相关。在缺血性脑卒中组中，只有rs876537与血清CRP相关，且TC基因型患者中血清CRP浓度高于TT，CC基因型患者。

表1 IS组和对照组的基本资料比较

表2 两组CRP基因SNPs的基因型频率的比较

表3 两组CRP基因SNPs等位基因频率的比较

2.4 血清CRP与缺血性脑卒中的关系校正年龄与性别后，血清CRP水平每增加一倍，患缺血性脑卒中的危险就会增加13%（3.4%～23.4%，P=0.007）；校正年龄、性别、体质指数（BMI），收缩压，TC，HDL-C后，血清CRP水平每一倍的升高会增加12%的危险。

3 讨论

本研究采用病例对照研究，对缺血性脑卒中患者及健康对照的血清CRP浓度及CRP基因的SNPs进行检测，发现rs1130864位点中AG基因型与缺血性脑卒中的发病相关，AA基因型在汉族人群中较为罕见。rs876537，rs1205，rs3093059与自然人群中血清CRP水平相关；在病例组，只有rs876537与血清CRP水平相关。多重校正后，CRP水平每增加一倍，患IS的风险增加12%。

表4 SNP不同基因型间CRP浓度的比较

rs1130864与缺血性脑卒中的关联研究已多次被报道，但其结果却存在争议。Du等[7]在一项病例对照研究中发现，rs1130864与rs3053059与其单体型与缺血性脑卒中均不相关。而陈芳等[8]研究结果表明rs1130864隐形模型（AA+GA）为缺血性脑卒中的危险因素，与本研究结果一致。在另一项包括了1716例IS患者的研究结果表明，在调整了潜在的混杂因后，rs1130864是缺血性脑卒中发病三月内不良结局的预测因子[9]，因此，rs1130864对缺血性脑卒中的影响还需在大规模人群中验证。

个体CRP水平是受遗传因素的影响可达到22%～56%[10,11]，Morten等研究表明，在欧洲人群CRP基因4个SNP（rs3091244，rs1130864，rs1205，rs3093077）的基因型组合最多可解释62%的CRP水平的变异[12]。在一项针对中国人群的横断面研究当中，rs3093059和rs1205与高水平的CRP浓度相关。在一项研究对象为亚洲人群的GWAS研究中，rs876537被认为是与CRP水平最具有相关性的一个位点[13]。Shen等[14]发现rs876537在缺血性脑卒中组与对照组都与CRP水平相关，与本研究结果一致。

本研究结果显示CRP为缺血性脑卒中发病的危险因素，其基因中的rs1130864与缺血性脑卒中的发病相关，在自然人群中rs1205，rs876537，rs3093059与CRP浓度相关。由于CRP为心血管疾病的重要预测因子，但其因果关系尚不明确。探究基因型-CRP-脑卒中的关系可以为下一步的孟德尔随机化研究打下研究基础。