两种焦糖色的特征风味成分和4-甲基咪唑分析

林 琪， 金 涛， 罗睿林， 金发明， 张琦弦，姚 开， 何 强， 迟原龙,

(1. 四川大学轻纺与食品学院 健康食品科学评价研究中心，四川 成都 610065; 2. 绵竹市土门食品厂，四川 德阳 618200;3. 成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610041)

0 引 言

焦糖色是食用色素中用量最大、使用范围最广的天然食品添加剂之一，它可以显著提升食品的色泽和风味等感官品质，主要应用于调味品、饮料、糖果中[1]。焦糖色的生产方法主要为普通法和亚硫酸铵法，两种方法均是以碳水化合物为原料，通过加热制得焦糖色。二者的主要区别在于，亚硫酸铵法需要使用亚硫酸铵作为催化剂。普通法下糖类原料发生焦糖化反应的程度较低，在形成焦糖色的同时也会生成较丰富的醛、酮等挥发性化合物。亚硫酸铵法下糖类原料发生焦糖化反应的程度较高，糖裂解形成的小分子物质在亚硫酸铵催化下会生成更加深色的化合物[2]。另外，焦糖色生产过程中，氨(铵)类化合物可能反应生成危害物质4-甲基咪唑[2-3]，国家标准限定焦糖色中4-甲基咪唑的含量不得超过200 mg/kg[4]。因此，有研究主要致力于通过改进原料和工艺，以制得不含或者仅含低量4-甲基咪唑的焦糖色[5]。

不同生产方法下制得焦糖色的特征风味成分以及4-甲基咪唑含量可能存在较大差异[6-7]。已有研究中，Paravisini等[8]发现焦糖色的特征风味物质为辛醛和2,4-二羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮，主要表现为甜味、坚果味、烘烤味。杨伟等[9]发现浓缩对焦糖色的风味物质具有较大影响，杂环类化合物是焦糖色的主体风味物质。黄志勤[10]和翟文静[11]分别采用分光光度法及液质联用法对焦糖色中的4-甲基咪唑进行了测定。尽管如此，不同生产方法对焦糖色特征风味成分和4-甲基咪唑的影响却鲜有报道。

对普通法和亚硫酸铵法制得的焦糖色中的特征风味成分和4-甲基咪唑进行分析，不仅可为它们的风味特征和风味差异提供数据支撑，还可判定焦糖色的安全性，从而为制得具有较佳风味且仅含低量或不含4-甲基咪唑的焦糖色生产工艺优化提供基础数据。

本文采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)法检测普通法和亚硫酸铵法焦糖色中挥发性成分的种类和含量，并探讨两种焦糖色特征风味的差异。采用高效液相色谱(HPLC)法测定两种焦糖色的4-甲基咪唑含量。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

普通法和亚硫酸铵法焦糖色由四川省德阳市某焦糖色生产厂家提供。4-甲基咪唑标准品(CAS：822-36-6)购于上海sigma公司；3-辛醇、甲醇、三氯甲烷为色谱纯试剂；其他化学试剂均为国产分析纯。50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相萃取头，美国Supelco公司；QP2010型气相色谱-质谱联用仪，日本Shimadzu公司；LC-16型高效液相色谱仪，日本Shimadzu公司；722S分光光度计，上海棱光技术有限公司。

1.2 焦糖色挥发性成分的检测

采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(SPME-GC-MS)，以3-辛醇作为内标物[12]，对焦糖色的挥发性化合物进行定性和半定量分析。

以甲醇为溶剂，配制质量浓度为135 mg/L的3-辛醇内标液。采用NIST14s谱库检索，结合保留指数及相关文献进行人工谱图解析，确定两种焦糖色的挥发性成分。采用焦糖色各成分峰面积与内标物峰面积对比，进行半定量分析[13]，计算公式为

式中：Cd——焦糖色挥发性成分测定量，μg/kg；

A1——焦糖色挥发性成分峰面积；

A2——内标物峰面积；

m1——样品质量，g；

C2——内标液质量浓度，mg/L；

V2——内标液添加体积，μL。

SPME条件：取5 g焦糖色样品于20 mL顶空瓶中，加入1 g氯化钠和2 μL 3-辛醇内标工作液，在40℃下用固相萃取头萃取焦糖色挥发性化合物30 min。

GC-MS条件：SH-Rxi-5silMS气相色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，进样口温度240 ℃，解析时间5 min。起始温度40 ℃，2 ℃/min升温至120 ℃，再12 ℃/min升温至240 ℃[9]。

1.3 焦糖色挥发性风味成分的确定

通过查阅相关文献及书籍[14-18]确定具有风味的挥发性物质为焦糖色挥发性风味成分，并将挥发性风味成分含量在20 μg/kg以上的物质确定为特征风味物质。

1.4 焦糖色中4-甲基咪唑的检测

对焦糖色中的4-甲基咪唑进行萃取，再采用高效液相色谱仪(HPLC)，以4-甲基咪唑标准品为对照物，对萃取得到的4-甲基咪唑进行定性和定量分析。

精确称取4-甲基咪唑标准品10 mg，用去离子水定容至100 mL，得到4-甲基咪唑质量浓度为100 mg/L的标准储备溶液。分别取该标准储备溶液0.10，1.00，2.00，4.00，10.0 mL，用去离子水定容至100 mL，得到质量浓度为0.10，1.00，2.00，4.00 ，10.0 mg/L的标准溶液。用HPLC检测标准溶液，记录4-甲基咪唑的保留时间，并以4-甲基咪唑质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。

萃取条件：取1 g焦糖色样品于250 mL分液漏斗中，依次加入5 mL 100 g/L碳酸钠溶液、16 mL三氯甲烷和4 mL乙醇，振荡萃取5 min，静置分层后收集有机相。采用相同方法对水相进行二次萃取，合并两次萃取相。经清洗、脱水、减压浓缩后，以去离子水定容至1 mL，经0.45 μm滤膜过滤后，HPLC检测4-甲基咪唑的含量[19]。

HPLC条件：Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为0.05%氨水和乙腈(体积比为1:4)，流量0.8 mL/min，检测波长210 nm，进样量10 μL。

1.5 焦糖色内含物质校正含量的换算

焦糖色添加剂一般呈液态，不同生产方法，甚至不同批次的焦糖色可能存在浓度差异。为了使其中的物质含量具备可比性，需要将不同焦糖色的浓度换算到同一基准浓度。为此，国家标准规定，焦糖色中的物质含量需换算为焦糖色基准浓度时的含量[4]。所以，按照国标方法，首先测定焦糖色在610 nm下的吸光度与浓度的比值E，再将1.2、1.3和1.4中检测得到的挥发性成分、挥发性风味成分和4-甲基咪唑含量换算为E为0.1时的含量值，即为校正含量[4]。

E的测定：精确称取约0.5 g焦糖色，用去离子水溶解并定容至500 mL，并用分光光度仪在610 nm处测定其吸光度(吸光度控制在0.2～0.8之间，否则应调整焦糖色浓度，再重新测定吸光度)。按下式计算E：

式中：A——焦糖色溶液的吸光度；

C——焦糖色溶液的浓度，g/L。

按下式进行校正含量换算：

式中：Cc——校正含量，μg/kg或mg/kg；

Cd——检测含量，μg/kg或mg/kg。

1.6 数据统计分析

采用Excel 2013对样品中挥发性化合物种类及含量进行统计分析，采用Origin 9.0进行作图。

2 结果与讨论

2.1 焦糖色中挥发性成分分析

普通法和亚硫酸铵法焦糖色中含有8类挥发性成分，分别为呋喃、醇、酸、酮、烃、吡咯、醛和其他，它们的含量和数量见表1。可以看出，普通法焦糖色中挥发性成分总含量(663 μg/kg)和数量(35种)均明显高于亚硫酸铵法焦糖色中挥发性成分总含量(175 μg/kg)和数量(25种)，表明普通法焦糖色中含有更丰富的挥发性物质。在各类挥发性成分中，呋喃、醇、醛和酮类是两种焦糖色中主要的挥发性物质，它们含量和数量分别占总挥发性成分的80%和60%以上，这与Laurianne Paravisini等[8,20]发现焦糖色主要风味物质为杂环、碳环和酸类化合物的结果相似。

表1 普通法和亚硫酸铵法焦糖色中8类挥发性成分的含量和数量

2.2 焦糖色中风味成分分析

普通法和亚硫酸铵法焦糖色中分别含有12种和13种挥发性风味成分，其化合物种类、特征风味和含量见表2。普通法焦糖色中风味成分总含量(493 μg/kg)远高于亚硫酸铵法焦糖色中风味成分总含量(164 μg/kg)，表明普通法焦糖色具有更好的风味。将含量高于20 μg/kg的化合物作为焦糖色中特征风味成分，则普通法焦糖色特征风味成分为乙酸、糠醇、2-乙酰呋喃、2-吡咯甲醛、5-甲基糠醛和N-糠基吡咯(见图1（a）)；亚硫酸铵法焦糖色为糠醇、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、2-吡咯甲醛和呋喃酮(见图1（b）)，所以两种焦糖色均表现出咖啡、麦芽、焙烤、杏仁、甜香和焦糖等特征风味，且普通法焦糖色的这种特征风味更强。由于亚硫酸铵法焦糖色在加工过程中添加铵盐和亚硫酸盐作为催化剂，碳水化合物原料的美拉德和焦糖化反应的方向与程度会与普通法工艺不同，因此两种焦糖色的特征风味会存在差异[2]。此外，焦糖色中一些含量较低的物质，如5-羟甲基糠醛和甲基糠基二硫，由于具有较低的阈值，也对焦糖色的风味产生影响[14]。

表2 普通法和亚硫酸铵法焦糖色中挥发性风味成分的种类和含量1）

图1 普通法焦糖色和亚硫酸铵法焦糖色中特征风味物质的气相色谱图

2.3 焦糖色中4-甲基咪唑含量分析

4-甲基咪唑在HPLC上的保留时间为5.288 min，标准曲线方程为y=451.18x–25.34，线性范围为0.1～10 mg/L，相关系数为0.999 9，该方法可以准确测定样品中4-甲基咪唑的含量。经过HPLC测定和校正含量换算，普通法和亚硫酸铵法焦糖色中4-甲基咪唑的含量分别为1.49 mg/kg和1.75 mg/kg，远低于焦糖色中4-甲基咪唑的国家限量标准(200 mg/kg)，表明这两种焦糖色具有较好的安全性。

3 结束语

本文通过研究发现，普通法焦糖色比亚硫酸铵法焦糖色具有更优的风味。普通法焦糖色的特征风味成分为糠醇、2-乙酰呋喃、2-吡咯甲醛、N-糠基吡咯、5-甲基糠醛和乙酸；亚硫酸铵法焦糖色为5-甲基糠醛、糠醇、2-吡咯甲醛、2-乙酰呋喃和呋喃酮，均表现出咖啡、麦芽、焙烤、杏仁、甜香和焦糖等特征风味，且普通法焦糖色的特征风味更强。两种焦糖色中4-甲基咪唑含量均远低于国家限量标准，具有较好的安全性。