丙烯酸接枝对酶法制备丝素基吸水材料的影响

2018-08-15周步光刘月鸣范雪荣

生物学杂志 2018年4期

周步光，刘月鸣，王平，王强，范雪荣

(江南大学生态纺织教育部重点实验室，无锡 214122)

高吸水性树脂是一种含有强亲水基团，交联网状的功能高分子材料，具有很强的吸水和保水能力，在环境治理、土木建筑、抗旱保水等领域得到了广泛的应用[1-4]。传统的高吸水材料如丙烯酸盐类树脂存在难生物降解、易造成环境污染等问题，目前研究开发生物降解性能的吸水材料已成为趋势。其中利用高分子吸水树脂和天然大分子物质进行共聚反应，制备可降解的高吸水树脂是当前的研究热点[5-7]。

丝素蛋白(SF)是蚕丝的主要组成部分，具有良好的生物相容性和可降解性，含有约10%的酪氨酸酚羟基和大量酰胺键邻位的α-H，有较高的反应性，可以通过化学法(过硫酸铵或过硫酸钾氧化还原引发剂)或紫外法(光引发剂)与外源功能化合物进行接枝共聚，构建丝素基功能复合材料[8-9]。相比而言，生物酶催化接枝共聚条件温和，具有特异性和选择性，能减轻环境污染，所以本研究主要侧重于用氧化还原酶体系引发SF与乙烯基单体的接枝共聚合。实验以SF为原料，借助于EDC/NHS接枝AA引入双键，促进SF与AA和AM分子的辣根过氧化物酶(HRP)体系催化接枝聚合效果，探究接枝AA对制备丝素基吸水材料性能的影响(文中所有缩写见附表)。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蚕丝练白绸(35.5 g/m2，江苏鑫缘茧丝绸有限公司)；辣根过氧化物酶(HRP酶活>300 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；丙烯酰胺(AM)、丙烯酸(AA)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、乙酰丙酮(ACAC)、无水氯化钙(CaCl2)、乙醇(CH3CH2OH)、吗啉乙磺酸(MES)等分析纯试剂，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 丝素溶液制备

以物质的量比n(CaCl2)∶n(CH3CH2OH)∶n(H2O)=1∶2∶8溶液溶解真丝绸[10]，在75℃水浴条件下搅拌3 h使蚕丝充分溶解得到丝素溶液，装入透析分子质量为8000～14 000 u的透析袋中用去离子水对丝素溶解液进行透析，直至透析液电导率值小于4 μs/cm，再将丝素溶液离心(10 000 r/min，5 min)去除不溶物，以称重法标定丝素蛋白溶液的浓度，将丝素溶液保存在4℃冰箱中备用。

1.2.2 丙烯酸接枝丝素反应

取丝素蛋白和丙烯酸的物质的量比为n(SF)∶n(AA)=1∶1，EDC的用量为SF和AA总量的20%，且n(EDC)∶n(NHS)=2∶1。先使用NaOH调节MES缓冲液的pH为5.5，然后将一定量的AA、EDC和NHS加入MES缓冲溶液中活化30 min，再加入5 g/L SF溶液反应4 h，反应结束后将反应液透析48 h除去未反应的AA后进行溶液性能测试。不同对照样品有纯SF溶液、SF(EDC/NHS)。

1.2.3 HRP催化SF-g-AA/AA/AM复合吸水材料制备

设定乙烯类单体反应物质的量比为n(AA)∶n(AM)∶n(MBA)=2∶1∶0.05，加入含有接枝后的丝素蛋白的缓冲溶液中(含AA样品用NaOH将溶液中和至pH 7.0)，再加入300 μL ACAC和1 mL(1 mg/mL HRP)酶溶液，放入三口烧瓶中通氮气30 min，逐滴加入100 μL 30% H2O2，加样结束后继续反应4 h。不同对照样品有SF/AA/AM/MBA、AA/AM/MBA，反应后放入聚四氟乙烯模具内在-18℃冰箱中冰冻4 h，随后放入-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥24 h完成膜材料的制备。

1.3 分析测试方法

1.3.1 游离氨基测试

1)茚三酮测试法。取1 mL丝素反应液和2 mL茚三铜溶液加入10 mL 离心管中，沸水煮20 min后冷却15 min，再加入5 mL含0.2%(W/V)KIO3的乙醇稀释液中，混匀后用LV-1800测定569 nm的吸光度。(茚三酮溶液的配制方法：0.06 g/mL KH2PO4、0.1 g/mL Na2HPO4、3 g/L果糖、5 g/L茚三酮，加去离子水溶解)。

以甘氨酸做出标准曲线计算游离氨基的浓度：

Am=1.7697Cm-0.0013

(1)

式(1)中：Am是569 nm可见光条件下溶液的吸光度；Cm为谷氨酸浓度(μmol/mL)。

2) OPA测试法。取200 μL丝素反应液和4 mL OPA混匀后在室温条件下反应2 min，然后测定混合液在340 nm处的吸光度值；空白样是在OPA试剂中加入200 μL水。OPA试剂的配制方法：准确称取40 mg/mL邻苯二甲醛/甲醇溶液，然后分别依次加入20%(W/V)的SDS溶液，0.1 mol/L硼砂溶液以及2 μL/mL β-巯基乙醇，需即配即用。

以L-亮氨酸做出标准曲线计算游离氨基的浓度：

An=0.3488Cn-0.0561

(2)

式(2)中：An是340 nm紫外光条件下溶液的吸光度；Cn为L-亮氨酸浓度(μmol/mL)。

1.3.2 双键滴定法

实验采用溴酸钾-溴化钾化学滴定法来测定溶液中双键的含量[11]。在SF和AA经EDC/NHS交联体系反应后的溶液中加入双倍体积乙醇析出丝素蛋白，离心(4000 r/min，5 min)。取10 mL上层清液置于250 mL碘量瓶中，加入2 mL丙酮，20 mL溴标准溶液以及5 mL盐酸溶液充分混匀，置于4℃冰箱中冷藏30 min，取出后再加入15 mL碘化钾溶液再次冷藏5 min，加入100 mL去离子水，立即用Na2S2O3标准溶液对其进行滴定，滴定至溶液呈淡黄色，再加入3 mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失即为滴定终点，记下最终使用Na2S2O3溶液的体积，以此来计算溶液中双键的含量。

溴滴定法滴定3组样品：样品1为1.25 g/L丙烯酸稀释液，相当于SF与AA交联反应前的溶液；样品2为在EDC/NHS交联体系作用下AA和SF反应后的溶液经乙醇析出沉淀后取得的上清液；样品3为去离子水，作为空白样。计算公式为：

(3)

式(3)中，N1为交联反应后溶液中剩余AA的物质的量(mol)；C为Na2S2O3溶液的浓度(mol/L)；V3为在滴定样品3时所使用的Na2S2O3溶液的体积(mL)；V2为在滴定样品2时所使用的Na2S2O3溶液的体积(mL)。

(4)

式(4)中，N2为交联反应中参与反应的AA的物质的量(mol)；C为Na2S2O3溶液的浓度(mol/L)；V2为在滴定样品2时所使用的Na2S2O3溶液的体积(mL)；V1为在滴定样品1时所使用的Na2S2O3溶液的体积(mL)。

1.3.3 吸水性能测试

对得到的AA/AM/MBA(a)，SF/AA/AM/MBA(b)，和SF-g-AA/AA/AM/MBA(c)这3组吸水材料进行吸水倍率测试[12]。首先称取一定量的吸水材料样品，在水中浸渍不同的时间，后用滤纸吸干表面多余水分，再次称重，根据公式(5)计算材料的吸水倍率Q：

Q=(M2-M1)/M1

(5)

式(5)中，Q为吸水率(g/g)；M0为材料吸水之前的质量(g)；M1为材料吸水饱和后的质量(g)。

1.3.4 保水性能测试

保水率测试，将吸水饱和后的吸水材料样品，称重，常温(25℃)放置烧杯中24 h，然后取出称重。由公式(6)计算保水率R：

(6)

式(6)中，R为吸水材料的保水率(%)；W0为材料吸水饱和后的质量(g)；W1为放置24 h后的吸水材料的质量(g)。

1.3.5 重复吸水性测试

重复吸水性能测试，将吸水饱和后的丝素吸水材料烘干，再次按吸水倍率的测试方法，评价其重复吸水性能Q′。

1.3.6 缓释性能测试

取相同质量的各吸水材料样品分别放进等量的0.4%的还原红染液中，分别浸泡不同的时间，浸渍后吸取1 mL染液稀释5倍后，测514 nm处的吸光度值。用吸光度值A的大小来表示吸水材料所具有的包载能力[13]。

1.3.7 差示扫描量热法

采用TA-Q200差示扫描量热仪，以10℃/min的升温速度在0℃～400℃范围内对丝素和吸水材料进行热特性分析。其中，样品烘干后约取5.0 mg，氮气流速为50.0 mL/min。

1.3.8 表面形貌观察

使用SU1510扫描电子显微镜(日本日立株式会社)观察样品表观形貌结构，样品喷金处理，扫描时的加速电压为5 kV。

2 结果与讨论

2.1 丙烯酸接枝效果分析

在EDC/NHS交联体系作用下，AA接枝SF实际上是进行羧基与氨基的结合，因此，如果检测出反应液中游离氨基数量减少，则说明AA与SF确实反应生成了酰胺键。但是，由于丝素蛋白分子中本身就存在羧基，会发生自交联，也会导致游离氨基数量的减少，因此设置对照试验中则不加入AA。

在弱酸性加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应会生成蓝紫色的络合物。图1为茚三酮法测得溶液中氨基的含量。

图1 茚三酮法测溶液中游离氨基含量的变化

从图1中可以看出，没有加入EDC/NHS交联剂的样品中游离氨基含量几乎不变，加入EDC/NHS交联剂的SF溶液游离氨基含量随时间增加而下降，其中加入AA的样品游离氨基含量下降得更快。表明加入EDC/NHS交联剂之后，SF分子一部分发生了分子间(内)的自交联，消耗一部分游离氨基；另一部分SF分子中的氨基在EDC/NHS的作用下与AA中的羧基进行反应，消耗更多的游离氨基。这也间接说明了SF分子确实与AA分子发生了接枝反应(SF-g-AA)。

同时采用了OPA法测游离氨基含量，利用游离氨基与OPA(邻苯二甲醛)进行反应能够形成一种黄色络合物。图2为OPA法测得溶液中氨基的含量。

图2 OPA法测溶液中游离氨基含量的变化

图2中游离氨基含量的变化与图1的一致，进一步说明了SF分子与AA分子的接枝反应。

为进一步验证AA接枝上了SF，采用了溴滴定双键的方法。样品1～3(详见实验方法)消耗Na2S2O3的体积分别为101.7、106.4和114.9 mL，算出交联反应溶液中剩余的AA为8.5×10-4mol，参与接枝反应的AA含量为4.7×10-4mol。实验结果表明，反应时加入的AA的量比交联反应后溶液中剩余的AA的量大，说明溶液中的AA确实和SF进行了接枝反应。

附表(Attached list)

缩写对照表MES:吗啉乙磺酸EDC:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐NHS:N-羟基琥珀酰亚胺SDS:十二烷基硫酸钠ACAC:乙酰丙酮HRP:辣根过氧化物酶SF:丝素蛋白AA:丙烯酸AM:丙烯酰胺MBA:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺SF-g-AA:丝素接枝丙烯酸

图3 HRP催化反应后各体系的形态

Fig 3 Shapes of various systems after HRP-catalyzed reaction

2.2 丙烯酸接枝对丝素基吸水材料性能的影响

图3表示HRP催化反应后各体系的形态，未加入AM的体系呈淡黄色黏稠液体，最终能真正形成吸水材料的是HRP/H2O2催化体系催化形成的AA/AM/MBA(淡黄色透明凝胶状)、SF/AA/AM/MBA和SF-g-AA/AA/AM/MBA(淡黄色凝胶状)3种材料，说明AM起到了很好的骨架作用。以下关于AA对吸水材料性能影响的测定就以这3种为主。

AA与AM共聚物有较强吸水性，在二者体系中加入SF，SF不仅会辅助AM起到材料骨架作用，而且通过与AA、AM的接枝共聚，进一步提高材料的稳定性。

图4 膜材料的吸水倍率曲线

图4所示的是3种吸水材料的吸水倍率随时间的变化曲线。由图4可以看出，AA/AM/MBA吸水材料的吸水量最大，90 min时趋于饱和状态，最终吸水量在3种吸水材料中最大；SF/AA/AM/MBA吸水材料吸水量随时间的增加而增加，在1 h左右开始趋于饱和状态，最终吸水量在3种吸水材料中最小；SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料的初始吸水量在3种吸水材料中是最大的，20 min时吸水倍率就达到了113.87，1 h左右开始趋向饱和状态，最终吸水量在3种吸水材料中居中。SF/AA/AM/MBA吸水材料吸水速率及吸水量均不佳，但当丝素蛋白接枝丙烯酸后制成的复合吸水材料吸水速率快速增加，可在极短的时间里吸取大量水分，且最终的吸水量也有了很大的提高。这说明使用EDC/NHS交联体系使AA接枝到SF上，使SF分子上增加了大量羧基，使SF-g-AA亲水性能得到提高。因此SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料在使用效果上要优于SF/AA/AM/MBA。此外，当需要快速吸水时，SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料具有较大的优势。

图5 膜材料的保水率

图5是3种不同吸水材料的保水率。保水率的大小可以说明吸水材料的保湿能力。由图5可以看出，AA/AM/MBA吸水材料的保水率为96.31%，SF/AA/AM/MBA吸水材料的保水率为93.56%，SF-g-AA/AA/AM/NMBA吸水材料的保水率为94.8%。因此，AA/AM/MBA吸水材料的保湿性最好，而SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料的保水性能虽不如AA/AM/MBA，但优于SF/AA/AM/MBA吸水材料。由此说明，通过接枝AA，使得SF-g-AA形成的吸水材料对水的束缚能力得到提高，因此在通风条件下经AA接枝后的SF形成的吸水材料比没有接枝的SF形成的吸水材料保水性能好。

图6 膜材料的二次重复吸水倍率曲线

由图6可以看出3种吸水材料的二次重复吸水量均在20 min达到饱和，其中AA/AM/MBA吸水材料二次重复吸水量最大，而SF/AA/AM/MBA吸水材料的二次重复吸水量最少。表明AA的接入改变了SF的分子结构，使得最终形成的吸水材料的亲水能力得到提高，由此也说明，AA的接枝可以使丝素蛋白类吸水复合材料的重复利用性提高。

对吸水材料进行缓释性能的研究可以了解吸水材料对溶液中溶质和溶剂的吸收能力。缓释性能包括包载和释放两个过程，这里通过染液吸光度值的变化率来说明吸水材料的缓释性能。

图7 吸水材料对染液吸光度的影响曲线

由图7可以看出，AA/AM/MBA吸水材料在测试中吸光度虽然随时间增加而下降，但下降速度是最慢的，所以该吸水材料对溶质的吸收能力最弱；SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料吸光度下降速度最快，说明该吸水材料对溶质的吸收能力最强。由此说明AA/AM/MBA吸水材料的缓释性能最好，SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料的缓释性能最差，但包载能力突出。这说明AA的接枝使得SF分子对浓度较高的溶质吸收较快，从而加快其包载能力，使缓释性能降低。

2.3 丝素基吸水材料的热性能分析

分析吸水材料SF-g-AA/AA/AM/MBA的热力学转变温度，并与SF、AA/AM/MBA和SF/AA/AM/MBA共聚物作对比。从结果(图8)中可明显看出，120℃以下4个样品均有明显的吸热峰，主要是自由水和结合水的蒸发。SF在280℃处发生热分解；AA/AM/MBA吸水材料热分解发生在309℃；而SF-g-AA/AA/AM/MBA吸水材料热分解发生在303℃较未接枝的略有提高。表明SF的加入使AA/AM类吸水材料的热性能降低，但经过AA接枝后，吸水材料的热稳定性得到提高。由此可以说明接枝AA后的SF分子结构发生改变，具有了AA的良好性能，再与AA、AM在HRP体系的催化作用下发生接枝共聚反应形成的吸水材料热力学性能发生改变，产生耐热性能较好的吸水材料。