微波辅助萃取小米黄色素的响应面法优化

2018-08-15张永芳李富恒王润梅令狐梅

山西大同大学学报(自然科学版) 2018年4期

张永芳，李富恒，王润梅，令狐梅

（1.山西大同大学生命科学学院,山西大同037009；2.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150000）

目前关于小米黄色素提取的研究报道较多，诸如王海棠等[1]采用传统方法即有机溶剂提取小米黄色素，赵猛等[2]应用超声波技术提取黄色素，但是通过微波技术萃取小米黄色素的报道很少。本文采用微波辅助萃取技术从小米中提取黄色素并确定其最佳工艺。微波技术因其选择性强、加热速度快、便于控制、受热温度均匀、能耗低、节省操作成本的同时又低碳环保，所以在食品、化学合成分析、环保等领域得到广泛的应用。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

东方亮小米，由山西广灵东方物华农业科技有限公司提供。

1.2 主要试剂

无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸均为分析纯；镁粉。

1.3 主要实验仪器和设备

微波炉EG720KG4-NA，广东美的微波电器制造有限公司；80-3离心机、数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；XFB-200小型粉碎机，吉首市中诚制药机械厂；RE-5211旋转蒸发仪、SHZD型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；JH1102电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.4 实验方法

1.4.1 工艺流程

将小米粉5.00 g放入锥形瓶中，按照实验设定好的料液比加入一定量体积分数的乙醇，在恒温水浴锅中40℃浸提1 h，再在设定好的微波功率下微波辐射60 s使黄色素充分释放，静置弃去下层的沉淀，以4 000 r/min离心上清液10 min，得到含有黄色素的乙醇提取液在最大吸光值处测其吸光度值。

得到的色素提取液通过减压蒸馏得到浓缩后的高浓度小米黄色素溶液，再在烘箱中40℃烘干，最终得到黄色的粉末。这既可以回收乙醇又可以收获小米黄色素粉末。

1.4.2 检测分析

1.4.2.1 小米黄色素吸收波长的选择

对离心分离出的含黄色素的乙醇溶液，在不同的波长下测吸光度值，设定波长分别为400、415、430、445、460、475、490、505 nm。以体积分数为90%醇为空白对照，实验重复3次取平均值。

1.4.2.2 小米黄色素的特殊显色反应

1)浓盐酸显色反应用实验在最佳工艺条件下制得的小米黄色素粉末配置成乙醚溶液，缓缓地加入浓盐酸，振荡片刻，观察现象；

2)浓硫酸显色反应用实验在最佳工艺条件下制得的小米黄色素粉末配置成乙醚溶液，缓缓加入浓硫酸，观察现象；

3)盐酸-镁粉反应取实验在最佳工艺条件下制得的小米黄色素的乙醇提取液5 mL到试管中，加入少许镁粉振荡，再用移液管加入几滴盐酸，观察现象[3]。

1.4.2.3 小米黄色素含量的测定

对收获的黄色粉末进行称量，实验重复3次取平均值。小米黄色素含量按下列公式计算：

1.5 单因素实验设计

利用单因素实验，研究微波辐射功率、微波辐射时间、料液比、乙醇体积分数对小米黄色素提取液的吸光度的影响，并对4个因素的实验结果进行分析。

4个因素的实验范围为:设定微波辐射功率为140、280、420、560、700 W；辐射时间为30、40、50、60、70、80；料液比为1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15；乙醇体积分数为60%、70%、80%、90%、95%无水乙醇。

以1.4.2.1所选定的波长作为检测的吸收波长，并以吸光度值作为评价指标。每一个因素重复进行3次取平均值。

1.6 响应面优化实验设计

在单因素实验的基础上，选取3个因素并对每一个因素选取3个水平，利用Design Expert 8.0.6软件，根据Box-Benhnken实验设计原理，优化微波萃取工艺。

以微波辐射时间、微波辐射功率和乙醇体积分数作为优化的3个因素，以小米黄色素提取液的吸光度为响应值。水平设计见表1。

表1 微波辅助提取小米中黄色素的因素水平设计

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

按照1.4.2.1三组重复实验得不同波长下的吸光度值取平均值，将其绘制为图1。可以看出，小米黄色素的乙醇提取液的吸光度在波长445 nm时为最大值，因此选用445 nm的波长进行实验较为合适。

图1 微波提取小米黄色素最大波长的确定

2.2 色素显色反应现象及结果分析

采用在最佳工艺条件下制得的小米黄色素粉末，配置成的乙醚溶液，并采用在最佳工艺条件下提取的小米黄色素的乙醇提取液，进行显色反应，实验现象及结果分析见表2。

2.3 单因素实验分析

2.3.1 乙醇体积分数对微波小米黄色素提取效果的影响

称量适量小米粉，料液比设为1∶10，以乙醇溶液体积分数的差异作为控制因素，研究其对吸光度的影响。按1.4.1的工艺流程，40℃恒温水浴，浸提1 h，设定微波功率350 W，微波时间60 s，微波辐射提取小米黄色素，最后离心分离得含黄色素的乙醇溶液。从图2看出，微波萃取获得的提取液吸光度随着乙醇体积分数的提高而提高，但使用无水乙醇作提取液时吸光度有降低趋势。

图2 乙醇体积分数对微波提取小米黄色素的影响

2.3.2 料液比对微波萃取小米黄色素效果的影响

称取适量小米粉，以90%乙醇溶液作提取液微波辐射60 s，设定不同料液比研究其对吸光度的影响。提取过程参照1.4.1，通过对料液比的控制，可达到对提取过程中传质推动力的控制，从而有效的改变提取效果[4]。从图3看出，在微波提取过程中小米黄色素提取的效果与料液比的增加呈现相同的趋势，但当料液比增加到1∶7之后，提取液的吸光度基本上没有变化。这可能与料液的饱和度有关。故最终实验选取的料液比为1∶7。

表2 色素显色反应的现象及结果分析

图3 料液比对微波提取小米黄色素的影响

图4 微波辐射功率对微波提取小米黄色素的影响

2.3.3 微波辐射功率对微波萃取小米黄色素效果的影响

称取适量小米粉，以90%乙醇溶液作提取液微波辐射60 s，设定不同微波辐射功率研究其对吸光度的影响。从图4看出，增大微波辐射的功率有利于小米黄色素的浸出，辐射功率560 W时提取液的吸光度达到最大值，继续增大微波辐射功率提取液的吸光度有所下降。故最终实验选取的微波辐射功率为560 W。这可能是因为辐射功率的高低与提取液吸收微波能的多少和微波对色素结构的破会程度有关。增大功率有利于有效成分溶出，但功率过高时，强热效应对有效成分的破坏程度也会随着增加，从而使再增大功率提取效果并不是很好[5]。最终实验选取的提取功率为560 W。

2.3.4 微波辐射时间对微波萃取小米黄色素效果的影响

称取适量小米粉末，以90%乙醇溶液作提取液微波辐射60 s，设定料液比为1∶10，研究不同微波时间对小米黄色素提取液吸光度的影响。从图5看出，微波辐射时间增加到70 s时，吸光度达到最大，继续增大微波辐射时间，吸光度开始下降。分析可能是因为微波萃取时间的延长加大了微波对色素结构的破坏。故最终实验选取的微波辐射时间为70 s。

图5 微波辐射时间对微波提取小米黄色素的影响

2.4 响应面法优化微波提取小米黄色素工艺

2.4.1 响应面优化

根据单因素的实验结果，确定对提取效果影响较大的3个因素，应用Design Expert 8.0.6软件的Box—Benhnken中心组合实验设计原理，以3因素3水平的方式进行优化。从以上的单因素分析可以看出，当料液比增至1∶7时，作为响应值的吸光度并没有增加的趋势，而其余3个因素都可以取到最高峰，所以优化实验以1∶7作为最佳提取料液比，以其余3因素作为对微波提取小米黄色素的影响显著的因素。水平设计见1.6所设计的表1。设计分析的结果见表3。

表3 微波辅助提取小米黄色素的工艺优化响应面实验设计及结果

2.4.2 模型的建立及显著性检验

以表3所得的实验数据，进行二次回归分析，得到以吸光度为目标函数的二次回归方程的模型为:R=0.75-0.048×A+0.024×B+0.029×C-9.750×E-003×A×B+4.250×E-003×A ×C-0.023×B×C-0.16×A2-0.028×B2-0.063×C2(R表示吸光度)。

表4为响应面的二次回归模型的方差分析。该模型的P值小于0.000 1，表示该模型显著，也就是说该回归方程可以很好地表示微波辐射时间、微波辐射功率和乙醇体积分数这3个因素与响应值之间的真实关系。实验探究的最终目的可以通过该回归方程确定。

从方差分析表可以看出，其中对该模型影响极显著有一次项中的A、B、C与二次项中的A2和C2对，对该模型影响显著有交互项中的BC和二次项中的B2。

利用Design Expert 8.0.6软件得出各交互项的响应面图和等高线图。响应面图是一个三维空间曲线图，可以从响应面图的倾斜程度和曲面颜色加深趋势等方面来判断因素间交互作用的显著性。曲面的倾斜程度则反映了各因素对实验结果的影响程度，越陡表明各因素对响应值的影响越大。等高线图相当于响应面图的投影，其性状反映了各因素交互的强弱程度[6]。等高线上各点处的提取方案，实验得到的色素吸光度与理论上相同。

表4 方差表的响应面二次型方差分析的方差分析

图6～8反映了实验设定的交互项与响应值间的交互关系响应面图和等高线图。通过对3组图的比较可知，微波辐射时间、微波辐射功率和乙醇体积分数对小米黄色素提取效果的影响依次降低。

响应面优化设计多角度全方位的考虑到实验设定的各因素与提取液吸光度间的内在联系，通过方差分析和三维图直观反映之间的规律，达到立体直观，高效快捷的效果。

3 结论

本实验应用Design Expert 8.0.6软件的Box—Benhnken中心组合实验设计原理，确定萃取的最佳参数为：乙醇体积分数94%，微波辐射时间74 s，微波辐射功率580 W，在此条件下小米黄色素提取液的吸光度可达0.759，最终得率可达10.23%。显色反应表明小米黄色素中除了含有类胡萝卜素外，还含有黄酮类物质。