miR34a在戊四氮致癫痫大鼠中通过下调Bcl-2导致神经元凋亡

癫痫(Epilepsy，Ep)是由多种原因导致的慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征，以脑神经元异常放电为主要特征的神经退行性病变，被WHO列为重点防治的五大神经疾病之一，它严重危害人类的健康，影响患者的生活质量。目前临床治疗癫痫的方法有多种，如手术、抗癫痫药物等，然而大约三分之一的癫痫患者仍然无法控制癫痫发作[1，2]，因此，开发癫痫的新疗法，更好地了解癫痫发生机制显得尤为重要。目前MicroRNAs(miRNA)为癫痫发生及治疗靶点的发现和生物标志物寻找的研究热点。

miRNA是一类内源基因编码的单链的非编码小RNA，在动植物及微生物等低等生物中广泛存在，在胚胎发育、细胞分化和器官生成等重要过程中承担着关键性的调控功能。这些短RNA能与靶基因的mRNA配对并阻碍其翻译，可作为基因表达的转录后调节因子。最近的研究表明miRNA能参与脑功能的调节，如神经炎症[3]、突触重建[4]、神经元凋亡[5]等。有研究表明miRNA34a可以促进细胞凋亡[5]。

细胞凋亡(apoptosis)又称为细胞程序性死亡，在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族成员起至关重要的作用。而Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中十分重要的一员，可以参与细胞内源性凋亡途径的起始阶段[6]，并且Bcl-2是抗凋亡蛋白可以阻止细胞凋亡这已经是不争的事实[7]。而且我们前期研究发现癫痫大鼠海马中Bcl-2明显下调[8]。

为此我们探讨miRNA34a是否可在癫痫中通过调节Bcl-2影响大鼠海马神经细胞凋亡进而影响癫痫的发作，这将有助于人们更好的了解癫痫的发生机制。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物与分组 将24只健康雄性Wister大鼠(哈尔滨医科大学)饲养在佳木斯大学动物实验中心并随机分为两组，每组12只。正常组(NC组)每天只接受腹腔注射生理盐水，癫痫组(Ep组)每天腹腔注射戊四氮(40 mg/kg)诱导癫痫发作模拟人颞叶癫痫[9]。

1.1.2 药品及试剂 miR34a引物由上海生物工程有限公司合成：miRNA34a序列如下：正向：5’- ATACCGCTCGAGCCTCCTGCATCCTTTCTTT-3’、反向：5’-ATACCGCTCGAGCCTGTGCCTTTTTCCTTCC-3’;u6引物由miRNA第一链cDNA合成试剂盒提供。RNAeasyTM动物小RNA抽提试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);miRNA第一链cDNA合成试剂盒(上海生物工程有限公司);荧光定量PCR试剂盒(上海生物工程有限公司);Rabbit Anti Bcl-2(USA affinity)、Mouse Anti β-actin、Goat Anti-Mouse IgG、Goat Anti-Rabbit IgG(武汉博士德生物有限公司);彩虹245广谱蛋白Marker、PMSF(北京索莱宝科技有限公司);ECL化学发光液(上海碧云天生物技术有限公司)、戊四氮(Sigma)。其他试剂均由分子实验室提供。

1.1.3 主要仪器 组织切片机LEICA-RM2025(德国Leitz);电泳仪DYY-8C、垂直电泳槽DYCZ-24DN、湿法转膜槽DYCZ-40(北京六一生物科技);ABI7300实时荧光定量PCR仪(美国);荧光显微镜DMI4000B (德国Lecia)等。

1.2 方 法

1.2.1 动物模型的建立及Racine等级评分 24只(220±20) g健康雄性Wister大鼠，采用随机数表法将大鼠分成2组，每组12只。正常组(NC组)每天只接受腹腔注射生理盐水，癫痫组(Ep组)每天腹腔注射戊四氮(40 mg/kg)建立癫痫模型，连续注射28 d，每天观察大鼠的Racine评分等级(Racine等级评分标准见表1)。惊厥评定标准为连续3 d出现Ⅳ级及Ⅳ级以上评分的大鼠视为达到癫痫模型的标准。在最后一次施用药物的24 h后，用0.1 g/ml的水合氯醛(400 mg/kg)深度麻醉大鼠。采用随机数字表法将每组大鼠随机分为2组，一组大鼠心脏灌注固定取脑，左右大脑半球置于4%多聚甲醛中固定，另一组大鼠断头分离海马，将分离好的海马置于液氮中保存。

表1 Racine评分标准

1.2.2 生物信息学分析癫痫大鼠海马中差异表达的miRNA 从在线GEO数据库(http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/)中获取GSE49851的表达谱数据，采用GEO数据库中的GEO2R分析30 d癫痫持续状态大鼠与对照组大鼠的差异表达基因，采用默认的BenjaminiHochberg方法计算FDR，筛选FDR<0.05且排名前10位差异表达miRNA。

1.2.3 生物信息学预测可以调控Bcl-2的miRNA 通过DIANA Tools(http：//diana. imis. athenainnovation. gr/Diana Tools/index，php)和TargetScan(http：//www. targetscan. org/)预测可以靶向结合Bcl-2的上游序列的miRNA。再取与1.2.2分析结果有交集的miRNA进行后续分析。

1.2.4 qRT-PCR检测大鼠海马中miRNA34a的表达情况 称取5 mg的海马组织应用RNAeasyTM动物小RNA抽提试剂盒提取miRNA，用miRNA第一链cDNA合成试剂盒将提取的miRNA反转录成cDNA，再用miRNA荧光定量PCR试剂盒将得到的cDNA扩增。qRT-PCR反应条件如下：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s、退火/延伸60 ℃ 30 s、循环40次。采用2-△△Ct法分析比较miRNA34a在正常大鼠海马组织和癫痫大鼠海马组织中的表达情况。

1.2.5 Western blot检测大鼠海马中Bcl-2的表达情况 称取30 mg的海马组织并加入270 μl的裂解液，使用研磨机将海马组织研碎后，静置30 min(4 ℃)，14000 r/min离心10 min(4 ℃)，取上清液。用Bradford法检测蛋白质的浓度，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀放入95 ℃的水浴锅中水浴10 min充分变性后恢复至室温。将样本于SOD-PAGE凝胶电泳(15%分离胶，5%压缩胶)，电泳至溴酚蓝离胶板最下端1 cm处停止。并按照marker和目的蛋白的分子量来切胶。转膜：将PVDF膜裁剪合适的大小，甲醇浸润15 s，用电转液将纤维层和滤纸浸湿。按照阴极-纤维层-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-纤维层-阳极顺序制作“三明治”，用恒流270 mA进行电转。转膜完毕后放入 5%脱脂奶粉封闭1.5 h(37 ℃)。一抗孵育4 ℃过夜(β-actin 1：1000，Bcl-2 1：200)。TBST 5 min/遍，洗3遍。二抗室温孵育1 h(HRP标记山羊抗小鼠IgG 1：1000 HRP标记山羊抗兔IgG 1：1000)。TBST 5 min/遍，洗3遍，ECL曝光。用相对灰度值(目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值)表示Bcl-2蛋白的相对表达情况。

1.2.6 Hoechst检测大鼠海马神经元的凋亡情况 从4%多聚甲醛中取出固定好的脑组织，取视交叉后4～5 mm即海马平面。进行常规石蜡包埋，切片(5 μm)，烤片，石蜡切片经二甲苯及梯度酒精脱蜡后用枸橼酸盐缓冲液水浴97 ℃ 15 min。PBS洗两遍，每次3 min。加入Hoechst 33258染色液，染色5 min。去除染色液，用PBS洗两遍，每次3 min。滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。荧光显微镜拍照(激发波长350 nm，发射波长460 nm)。Hoechst染色后，凋亡细胞核出现凝聚(固缩)和亮蓝色(蓝白色)。用ipp 6.0查同一片区域阳性细胞数和总细胞数，用阳性细胞数/总细胞数×100%表示细胞凋亡率。

2 结 果

2.1 Racine 评分等级 与NC组相比Ep组大鼠的Racine评分明显高于NC组(**P<0.01)，并且癫痫大鼠的Racine评分的Ⅳ级次数超过3次。(见图1)

图1 NC组与Ep组大鼠的Racine评分

2.2 癫痫大鼠海马中差异表达的miRNA 通过GEO数据库中的GSE49851的表达谱数据筛选出癫痫大鼠海马中高差异性表达前十位miRNA(见表2)。

表2 癫痫大鼠海马中高差异性表达的前十位miRNA

2.3 靶向Bcl-2的miRNA 通过DIANA Tools和TargetScan寻找可以靶向Bcl-2的miRNA结果再与2.2的结果取交集发现miRNA34a是唯一可以直接靶向Bcl-2的miRNA(见图2)。

图2 靶向Bcl-2的高表达的miRNA-34a

2.4 荧光定量PCR检测大鼠海马组织中miRNA34a表达量的结果 与NC组相比Ep组大鼠海马中的miRNA34a表达量明显高于NC组(P<0.01;**)(见图3)。

2.5 大鼠海马组织中Bcl-2的表达量 与NC组相比Ep组大鼠海马中的Bcl-2表达量明显低于NC组(**P<0.01)(见图4)。

2.6 大鼠海马神经元的凋亡情况 与NC组相比 Ep组大鼠CA1区海马神经元的凋亡率明显大于NC组(**P<0.01)(见图5)。

图3 Q-PCR检测大鼠海马组织中miRNA34a表达量

图4 Western blot法检测的Bcl-2表达量

图5 a：大鼠CA1区Hoechst染色情况;b：大鼠CA1区海马神经元的凋亡率

3 讨 论

癫痫是一种慢性神经系统疾病，其发病机制非常复杂且影响因素较多，目前通常认为与神经元死亡、神经元再生、神经胶质细胞再生、离子通道改变以及神经炎症有关[9]。本项目探讨miRNA介导的细胞凋亡机制对癫痫大鼠海马神经元产生的影响，这有助于我们进一步了解癫痫的发病机制。

戊四氮(Pentetrazol，PTZ)是一种中枢神经系统兴奋剂，对整个脑脊髓轴有影响。它可以引发全身强直- 阵挛性发作，PTZ点燃大鼠的癫痫模型与人类癫痫发作十分相似，具有病理反应局灶部位的确定性、渐进性、稳定性和持久性等优点，并且PTZ本身无神经毒性，不会直接造成神经元的损伤[10]，综上所述PTZ诱导的癫痫鼠符合我们的实验要求，是理想的癫痫动物模型。为此我们选用PTZ诱导的颞叶癫痫模型，研究miRNA34a对癫痫大鼠的影响及其可能的发病机制。

评价癫痫模型是否建立成功的方法有多种但大致分为2种：一种是脑电图;另一种是行为评分。其中行为评分在评估各种癫痫动物模型中是十分常见的，而Racine评分标准是行为评分中最常用的方法之一[11，12]。在我们的实验中Ep组大鼠的Racine评分标准连续3 d出现Ⅳ级及Ⅳ级以上Racine评分，这证明癫痫大鼠的模型建立成功，并且通过比较Ep组大鼠和正常对照组大鼠的Racine评分结果，我们发现Ep组大鼠与NC组大鼠在行为学上有明显的差别。

MicroRNAs(miRNA)是一类重要的非编码小RNA(～22nt)，可作为基因表达的转录后调节因子。其通过结合基因中的保守序列对转录后基因表达调控。它们对胚胎发育及正常细胞生理学至关重要。已有研究显示miRNA参与调节细胞周期和细胞凋亡，且miRNA功能障碍与神经退行性疾病有关[13]。2012年T Sano在大脑杏仁核内显微注射红藻氨酸的癫痫模型中发现癫痫可以诱导miRNA34a上调[14]，这与我们PTZ致癫痫鼠中miRNA34a表达上调结果一致，这说明癫痫可以诱导miRNA34a的上调。

癫痫发作和癫痫的持续状态都会导致神经元的缺失[15]。Pitkänen A等人发现在癫痫患者脑内的海马体积会逐渐变小[16]，这种神经元的缺失可导致认知功能发生障碍，并且会加重癫痫发作的严重程度。最重要的是神经元缺失与癫痫的发作直接相关[17]。有研究证实细胞凋亡可能是诱导神经元缺失的重要原因[15，18]，而Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中十分重要的一员，其主要功能是参与细胞内源性凋亡途径的起始阶段[6]，Bcl-2可与Bax和BH3-only蛋白结合防止线粒体外膜透化进而阻止细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中激活caspase，最终达到抗细胞凋亡的作用[19，20]。在我们的研究结果中发现癫痫鼠海马组织中Bcl-2的表达下调，且CA1区神经元凋亡率增加，说明持续癫痫可导致海马神经元的损伤。

我们通过生物信息学方法分析发现癫痫大鼠海马组织中差异性表达前10的miRNA中miRNA34a是唯一靶向Bcl-2的miRNA，并且其miTG score 高达0.99以上;最近Lin已证实miRNA34a可以靶向Bcl-2[21]。在本研究中我们发现Ep组大鼠海马组织中miR34a的表达量明显高于NC组(P<0.01)、Bcl-2的表达量明显低于NC组(P<0.01)、海马神经元凋亡情况明显高于NC组(P<0.01)。综合以上结果，我们推测miRNA34a对癫痫大鼠海马神经元具有损伤神经元的作用，并且其作用机制可能是miRNA34a下调Bcl-2表达导致海马神经元凋亡进而对癫痫大鼠产生影响，但如果要明确miRNA34a对癫痫大鼠的影响还需要进行大量的深入研究。本研究将有助于人们更好的了解癫痫的发生机制，为临床上治疗癫痫提供新的治疗靶点。