秃疮花针剂对小鼠淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的影响

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(1.甘肃省畜牧兽医研究所, 甘肃 平凉 744000；2.西北农林科技大学动物医学院)

秃疮花(Dicranostigma leptopodum (Maxim) Fedde，DLF)，又名红茂草、秃子花、勒马回(陕西)，为罂粟科秃疮花属二年生或多年生草本植物, 主要分布在甘肃、陕西、河南、山西、青海、宁夏、四川、云南、西藏等地。秃疮花药性据《全国中草药汇编》记载：“苦、涩、凉，有毒”；《陕西中草药》载：“味苦、涩，性凉”；《民间兽医本草》载：“味苦，性寒，有小毒”。 秃疮花全草有清热解毒、消肿止痛、杀虫等功效；对扁桃体炎、牙痛、咽喉痛、淋巴结核等有良好的疗效；外用于秃疮、疥癣、痈疽、瘘管、顽固性口炎、化脓性中耳炎、胃溃疡、外伤、带状疱疹、阴囊癣、阴户肿痛、霉菌性阴道炎疮等疾病。从上世纪80年代开始，我国许多研究者对秃疮花的成分和秃疮花制剂的药理作用进行了研究，畅行若等从秃疮花中提取出秃疮花碱、异紫堇碱、紫堇碱、原阿片碱、别隐品碱、青风藤碱等多种化合物。卢贤昭等研究表明，秃疮花制剂能调节动物免疫系统机能、对结核病和肿瘤等有良好的治愈作用、对多种细菌、病毒、真菌性疾病和外科创伤等有治疗作用。为了将秃疮药应用于临床实践中，本课题组在分析秃疮花全草生物碱成分的同时，进行了秃疮花制剂的研制和应用。在此基础上，进一步研究秃疮花针剂对小鼠淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的影响，为制剂的应用积累试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 Balb/c小鼠 购于第四军医大学试验动物中心。

1.1.2 制剂 秃疮花针剂由甘肃省畜牧兽医研究所制备。

1.1.3 仪器与材料 酶标仪(型号Model 680)、CO2培养箱(Asheville公司)、离心机等为西北农林科技大学动物医学学院预防兽医学试验平台仪器； 96孔细胞培养板、细胞计数板、0.1μL-1μL、1μL-10μL、10μL-100μL、100μL-1000μL、1mL-10mL加样枪及EP管等购于欣博盛生物科技有限公司。

1.1.4 试剂与药品 小鼠IL-4 ELISA试剂盒和小鼠IFN-γELISA试剂盒等为欣博盛生物科技有限公司；PBMI-1640培养液、HEPES、L-谷氨酰胺、ConA、犊牛血清、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaHCO3、葡萄糖、台盼蓝、青链霉素、两性霉素、多聚甲醛等购于欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 秃疮花针剂对小鼠的腹腔注射

1.2.1.1秃疮花针剂配制 取甘肃省畜牧兽医研究所制备的秃疮花针剂，按其所含干物质量用生理盐水配制成4 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL各100 mL, 4℃保存备用。

1.2.1.2 秃疮花针剂对小鼠的腹腔注射 取28日龄Balb/c小鼠28只，观察2d，随机分成4组。3组每天分别腹腔注射4 mg/mL、20 mg/mL、100 mg/mL的秃疮花内用制剂，0.2 mL/每只;另1对照组每天分别腹腔注射生理盐水，0.2 mL/每只。各组连续注射7 d。

1.2.2 秃疮花内用针剂对小鼠淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的影响

1.2.2.1 小鼠淋巴细胞的体外培养及培养上清液分离 将1.2.1.2处理的3个试验组和对照组中各5只小鼠，断颈处死，75%乙醇消毒，无菌条件下取小鼠脾脏，过200目筛网，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。分离的淋巴细胞分别用Hanks液(pH7.4)洗3遍，计数，将其用完全PBMI-1640营养液分别配成1×106个细胞/mL。分别取各组1×106个细胞/mL 500μL 淋巴细胞悬液，各分置于96孔细胞培养板组成5×4×4个培养孔，每孔100μL。每孔分别加入10μg/mL的ConA 100μL，5%CO2、37℃培养48 h。各孔培养物分别离心取上清，4℃保存待测。

1.2.3.2 小鼠淋巴细胞培养上清液IL-4及IFN-γ的测定 按小鼠IL-4 ELISA试剂盒和小鼠IFN-γELISA试剂盒操作步骤进行。

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 秃疮花针剂对小鼠淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的影响结果 秃疮花针剂对小鼠淋巴细胞分泌IL-4的影响结果见表1。从表1可以看出，3个试验组小鼠淋巴细胞分泌的IL-4与对照组相比差异极显著(P<0.01)，其中4 mg/ml注射组小鼠淋巴细胞分泌的IL-4最高，约是对照组分泌量的4倍。

表1 秃疮花内用针剂对小鼠淋巴细胞分泌IL-4的影响结果

注 ：末标记表示对照组与试验组之间差异不显著(P>0.05)；﹟﹟表示与对照组之间差异极显著(P<0.01)。

2.1.2 秃疮花针剂对小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ的影响结果 秃疮花针剂对小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ的影响结果见表2。从表2可以看出，3个试验组小鼠淋巴细胞分泌的IL-4与对照组相比差异极显著或显著(P<0.01或P<0.05)，其中4 mg/ml注射组小鼠淋巴细胞分泌的IFN-γ最高，约是对照组分泌量的37倍。

表2 秃疮花内用针剂对小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ的影响结果

注 ：﹟表示与对照组之间差异显著(P<0.05)；﹟﹟表示与对照组之间差异极显著(P<0.01)。

2.2 讨论

从秃疮花内用针剂对小鼠淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的影响结果看，小鼠腹腔注射秃疮花内用针剂7 d后，分离小鼠淋巴细胞，用ConA 刺激，5%CO2、37℃培养48 h后，小鼠淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ含量均明显增多。其中4-20 mg/ mL注射组分泌IL-4和IFN-γ含量比较高；而100 mg/ mL注射组IL-4含量和IFN-γ含量增量低一些，但与对照组相比还是差异显著。从分泌IL-4和IFN-γ增量上看，试验组小鼠淋巴细胞分泌的IL-4最高约是对照组分泌量的4倍，试验组小鼠淋巴细胞分泌的IFN-γ最高约是对照组分泌量的37倍，试验结果提示,秃疮花针剂能提高小鼠的细胞免疫和体液免疫水平;小鼠的细胞免疫水平远高于体液免疫水平，秃疮花针剂对细胞免疫调节的作用更大。试验结果还提示,秃疮花内用针剂处理7天后，小鼠淋巴细胞功能正常，秃疮花内用针剂对小鼠免疫系统没有不良影响。试验结果表明，秃疮花内用针剂对小鼠淋巴细胞有明显的调节功能，能提高小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。