种衣剂对丹参种子萌发及幼苗抗旱性的影响

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(陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心， 陕西 咸阳 712083)

丹参(SalviaemiltiorrhizaeBunge)又称红根，系唇形科(Lamiaceae)鼠尾草属(Salvia)多年生草本植物，在我国山东、陕西、四川等省份有广泛栽培，其干燥根为《中华人民共和国药典》收载中药丹参的唯一来源[1-3]。丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效，现主要为栽培药材，随着制药工业上对丹参药材需求量不断增加，其种植面积也不断扩大[3]。陕西地区自古就有种植丹参的传统，为丹参的道地性产区之一，陕西“商洛丹参”同时也是国家地理标志保护产品[5]。目前陕西地区多采取育苗移栽的方式种植丹参，通常在第1年6—7月间播种育苗，10—11月初或第2年春季移栽。丹参播种时正值夏季，气候炎热、地表温度高，受干旱影响而导致出苗率低、幼苗生长缓慢是目前该地区丹参种植面临的主要问题之一[6]。

种子包衣技术是提高种子质量、促进种子产业化标准化、预防病虫害的一项先进技术[7]。通过助剂和成膜剂可将生长调节剂、农药、微肥等包裹在种子表面并固化成种衣，使各种活性物质缓慢释放，起到调节植物生长，防病治虫和提高植物抗逆性等作用[8-9]。目前，在胡麻、甘草和黄芪等药用植物上均有应用种子包衣剂处理防治病虫害的报道[10-12]。针对目前陕西地区丹参在播种育苗阶段所存在的问题，本研究拟利用前期自研制的悬浮种衣剂包衣丹参种子，在模拟干旱处理的情况下，通过对种子萌发特性、幼苗生长和相关抗氧化保护酶活性进行检测，分析种衣剂对丹参生长发育和抗干旱的影响，以期为提高丹参育苗效率提供科学的方法。

1 材料和方法

1.1 实验材料

供试的丹参种子由陕西天士力植物药业有限责任公司提供，经陕西中医药大学李铂博士鉴定为丹参(SalviaemiltiorrhizaeBunge)的干燥成熟种子。

1.2 主要试剂

种子处理所用试剂为自研制的悬浮种衣剂[8]，其有效成分(按质量分数折百)为0.005%赤霉素GA3，0.003%水杨酸，0.001%复硝酚钠，0.001%DA-6(胺鲜酯)，5%平衡肥(含大量元素和微量元素)。分别称取一定量的原药、润湿剂、分散剂、增稠剂，以0.5%碱性品红作为警戒色，将各组分加入高剪切混合乳化机于25 ℃剪切混合0.5 h。随后在混合液中加入一定量的成膜剂于分散砂磨机(介质为锆珠，介质系数为1)中研磨3 h，制成种子包衣剂。

1.3 实验设计

选取饱满健壮、大小一致的丹参种子，按包衣比[包衣剂质量(g)∶种子质量(g)]1∶50分别置于封口袋中均匀混合，晾干后备用。种子萌发与苗期实验分别在培养皿和苗盘中，于恒温光照培养箱中培养进行。按照张春平等[13]的方法，将未包衣和包衣后的种子放入铺有2层湿润滤纸的培养皿中，以清水和20% PEG-6000溶液处理各种子，共设置4种处理： 1) 清水+未包衣种子， 2) 清水+包衣种子， 3) PEG+未包衣种子， 4) PEG+包衣种子。每个培养皿50粒种子，重复5次，光照与黑暗时间设为12 h/12 h，光照强度为2 000 lx，在培养箱中进行(25±1)/(15±1)℃的变温培养

1.4 实验方法

1.4.1 种子萌发特性指标测定

连续培养观察 10 d，每天定时统计种子萌发数，在第10天计算种子发芽率，在第5天计算发芽势，在第30天结合幼苗根长计算简化活力指数。

种子发芽率(%)=10 d发芽种子数/供试种子总数×100%；

发芽势(%)=5 d发芽种子数/供试种子总数×100%；

简化活力指数=种子发芽率×根长。

1.4.2 幼苗生长和生理特性指标测定

将种子按每盘50粒分别撒播种植于育苗盘中，育苗盘中介质为沙土(V/V=1∶1)，每种处理设3个重复，每5 d用喷壶浇清水或20% PEG-6000 1次，按照1.3的培养条件于光照培养箱中培养30 d，培养结束后每组处理选10株幼苗，分别测量其根长、株高和干重等指标，幼苗活力指数的计算参照黄文静等[13]的方法。

参照张宪政[14]的混合浸取法，以等体积混合的丙酮无水乙醇混合液浸提叶片，分光光度计测定663,645,470 nm处吸光值计算叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量。采用磺基水杨酸提取脯氨酸，并用茚三酮法测定其含量，MDA 的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)双组分光光度法，以μmol/g表示MDA的量[15]。

1.4.3 抗氧化保护酶活性测定[16]

超氧化物歧化酶(SOD) 活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)还原法，以U/(g·h)表示。过氧化物酶(POD)活性的测定以愈创木酚法进行测量，以每分钟A值减小0.01定义为1个酶活力单位[U/(g·min)]。过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用紫外吸收法测定，以每分钟A值减少0.1定义为1个酶活力单位[U/(g·min)]。

1.4.4 数据处理

所有数据用Excel软件处理作图，并采用SPSS 19.0软件进行差异分析。

2 结果与分析

2.1 种衣剂和干旱处理对丹参种子萌发和幼苗生长的影响

由表1可知，未包衣种子在正常状态下(清水处理)的发芽率为52%左右，20% PEG-6000模拟干旱处理使丹参种子发芽率降低至30%；种衣剂包衣能够明显提高丹参种子发芽率，分别比正常状态下和干旱胁迫下的未包衣种子高出28.24%和118.95%；包衣种子在干旱情况下仍能保持40%左右的发芽率，可见种衣剂包衣在一定程度上增强了种子的抗旱性。各处理间种子发芽势和简化活力指数的总体趋势与发芽率一致，表现为：清水+包衣种子>清水+未包衣种子>PEG+包衣种子>PEG+未包衣种子。除能够显著提高发芽率外，种衣剂包衣能够显著促进丹参幼苗生长，种衣剂包衣后的丹参幼苗根长、株高和单株干重均为各处理中最大值；干旱情况下丹参包衣种子的幼苗在根长和株高上大于未包衣种子的幼苗。

表1 种衣剂和干旱处理对丹参种子萌发和幼苗生长的影响

处理发芽率(%)发芽势(%)根长(cm)株高(cm)单株干重(g)简化活力指数清水+未包衣种子52.40±4.15b39.80±3.34b3.60±0.35a5.22±0.36b0.188±0.010b1.89±0.26b清水+包衣种子67.20±3.56a56.40±3.04a4.00±0.36a5.90±0.33a0.206±0.010a2.68±0.30aPEG+未包衣种子30.60±6.76d13.60±3.36d2.48±0.37c4.06±0.35d0.165±0.005c0.76±0.23dPEG+包衣种子40.80±2.16c23.80±3.27c2.98±0.31b4.68±0.28c0.176±0.005c1.22±0.18c

注：不同的小写字母代表5%的显著性。下同。

表2 种衣剂和干旱处理对丹参幼苗生理指标的影响

处理叶绿素a+b(mg/g)叶绿素a/b类胡萝卜素(mg/g)MDA(mg/g)脯氨酸(μg/g)清水+未包衣种子1.255±0.052b3.041±0.048b0.058±0.002b0.280±0.012a43.87±2.24b清水+包衣种子1.456±0.074a2.836±0.034d0.068±0.002a0.254±0.004b54.38±2.43aPEG+未包衣种子1.028±0.023c3.137±0.043a0.043±0.003d0.282±0.006a37.13±3.98cPEG+包衣种子1.312±0.045b2.893±0.030c0.050±0.002c0.276±0.006a42.48±1.67b

2.2 种衣剂和干旱处理对丹参幼苗生理指标的影响

叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，干旱胁迫会使植物的叶绿素含量降低，从而减弱光合作用，减少干物质合成。由表2可知，种衣剂包衣能够显著提高丹参幼苗叶片中的叶绿素和类胡萝卜素含量；干旱胁迫使2种光合色素的含量降低，而种子包衣能够在一定程度上抑制干旱引起的光合色素降解，比干旱情况下未包衣种子幼苗的叶绿素和类胡萝卜素分别高出27.45%和16.28%。MDA为膜脂过氧化的最终产物，其含量在一定程度上反映了细胞受到伤害的程度。通过检测各处理下丹参幼苗MDA含量发现，干旱胁迫下未包衣种子幼苗中的MDA含量最高达0.282 mg/g，但与干旱下包衣种子和正常情况下未包衣种子幼苗中的MDA含量差异不显著，而正常情况下包衣种子幼苗中的MDA含量最低，且与其他处理的差异达显著水平。脯氨酸是一种重要的渗透调节物质，多数研究认为其含量高低与植物的抗逆性呈正相关关系，通过检测发现，正常情况下包衣种子幼苗中的脯氨酸含量最高，包衣剂能够显著提高丹参幼苗脯氨酸含量，干旱条件下包衣种子幼苗中脯氨酸含量是未包衣种子的1.14倍，两者差异显著。

2.3 种衣剂和干旱处理对丹参抗氧化保护酶活性的影响

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)是植物对逆境胁迫反应的“晴雨表”，同时对于清除活性氧自由基、维持细胞膜的稳定性和完整性，提高植物抗逆性起着关键的作用。通过图1～图3可知，各处理下SOD、CAT和POD的总体趋势基本一致，表现为：清水+包衣种子>清水+未包衣种子>PEG+包衣种子>PEG+未包衣种子。正常情况下未包衣种子幼苗与干旱处理下包衣种子幼苗间的SOD以及CAT活性差异不显著(图1、图2)，这也从侧面反映了包衣剂能够在一定程度上提高干旱胁迫下丹参幼苗中抗氧化保护酶的活性，结合种子萌发特性和各处理下丹参幼苗的生长情况，可以明显看出种衣剂包衣增强了种子和幼苗的抗旱性，促进了丹参幼苗的生长。

图1 种衣剂和干旱处理对丹参SOD活性的影响

图2 种衣剂和干旱处理对丹参CAT活性的影响

图3 种衣剂和干旱处理对丹参POD活性的影响

3 结论和讨论

丹参大田育苗关键要解决“出得来”和“长得好”2个问题，高萌发率的种子和健壮的幼苗是今后进行移栽并保证药材产量和质量的基础。目前，陕西乃至整个西北地区的丹参播种育苗基本在麦收后进行，此时天气晴朗、气温较高，种子出芽和种苗生长易受干旱影响。通过前期研究，本课题组开发出针对这一问题的丹参种子专用包衣剂，该种子包衣剂活性成分为一定数量和种类的植物生长调节剂和微肥，此外种衣剂助剂有一定的保水和缓释功能。本次试验发现，通过包衣剂包衣后的丹参种子出芽率明显高于未包衣种子，在模拟干旱条件下包衣种子仍能保持40%的高出芽率，其种子发芽势、幼苗株高和根长也大于干旱条件下未包衣种子，说明种衣剂能够促进种子萌发和幼苗的生长，并在一定程度上增强了种苗的抗逆性。

通过对丹参幼苗相关生理指标进行检测发现，种衣剂包衣显著提高了幼苗总叶绿素和类胡箩卜素含量并降低了叶绿素a/b值，有研究表明，单位质量的叶片中较高的总叶绿素含量和较低的叶绿素a/b能够表明样品叶绿体中光系统Ⅱ捕光复合体(LHCⅡ)含量多，这有利于植株吸收其生长环境中的有限光能；而类胡萝卜素可以耗散叶绿素吸收的过多光能，使叶绿素不致因光氧化而遭破坏[17-18]。逆境胁迫引起活性氧升高导致了植物细胞膜系统的过氧化，而MDA则是膜脂过氧化的最终产物；脯氨酸作为渗透调节物质, 与蛋白质相互作用可增加蛋白质可溶性和减少可溶性蛋白的沉淀，从而保持细胞膜结构的完整性[5,19]。因此逆境胁迫下低MDA和高脯氨酸含量通常被认为是植物抗逆性增强的表现。本次研究发现，通过模拟干旱处理后丹参幼苗MDA含量略微升高，而脯氨酸含量则显著降低，结合种子出芽率的降低和幼苗生长受到的抑制，说明使用20% PEG-6000模拟干旱处理达到了理想的胁迫效果；而种子包衣剂处理能够抑制胁迫引起的脯氨酸含量降低，并使其保持在一个较高水平。

逆境胁迫通常导致细胞内活性氧的产生与清除平衡遭到破坏而出现活性氧的积累，从而影响细胞膜功能和植物的正常生长[19]；而植物体为了降低活性氧的毒害作用，其自身形成了活性氧清除系统，SOD、POD和CAT便是该系统的重要组成成员[20]。本次研究发现，非胁迫条件下丹参幼苗中抗氧化保护酶活性远高于胁迫条件下，种衣剂包衣能够使丹参幼苗SOD、POD和CAT活性再次提升到一个更高水平，可为丹参幼苗抵御因干旱胁迫引起的过氧化伤害提供生理保护。综上所述，丹参种子包衣后，其发芽率、发芽势和单株干重显著提高，幼苗中抗氧化保护酶活性、叶绿素含量和脯氨酸含量升高，丹参幼苗生长速度加快，对干旱的抗性得以增强。