水稻新品种玉稻518灌浆期POD动态分析

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(1.河南师范大学生命科学学院， 河南 新乡 453007； 2.河南省新乡市农业科学院， 河南 新乡 453000)

过氧化物酶(peroxidase，POD)是植物中广泛存在的一种氧化还原酶，它以过氧化氢为电子亲本催化底物氧化，参与体内活性氧的清除，在植物呼吸作用、光合作用以及抗逆等过程中起到重要作用。该酶在植物不同生长发育阶段的活性和种类，受到遗传物质直接调控和环境因素影响，因此可通过POD酶谱特征来分析某些表观性状的遗传变化[1-3]。

离子束诱变育种技术，是通过低能离子束辐照，使植物产生可遗传的变异，后经人工多代选择，培育植物新品种的一种育种方法[4-5]。在20世纪80年代，国内科研人员首先将低能离子束应用于水稻诱变育种，发现诱变后代中具有高突变率和宽突变谱的特点[6]，随后该技术普遍应用在作物诱变育种研究[7-9]。李金亭等[10]采用离子束注入萝卜，对诱变萝卜的幼苗POD进行电泳分析，发现真叶期POD酶谱出现1条Rf 0.61的酶带，减少1条Rf 0.22的酶带，证明离子注入能影响POD的表达；徐家萍等[11]采用离子束诱变鸡桑，提取芽中POD同工酶进行电泳分析，发现诱变后代与亲本在过氧化物同工酶酶谱及RAPD指纹上均存在差异，初步从分子水平证实离子束诱变能获得新的种质资源。赵俊杰等[12]对N+离子注入的小麦种子萌发期POD同工酶进行研究，发现根中POD同工酶检出一条新酶带，推测是离子注入引起POD同工酶基因表达改变。

以往关于水稻离子束诱变育种同工酶方面的研究，大多集中在对低代诱变材料的POD变化进行分析，对离子束诱变选育出的水稻新品种(指已稳定遗传且综合农艺性状优良的通过国家或省级作物品种审定的新品系)POD酶谱变化及与农艺性状关系的研究还未见报道。为了解离子束诱变的水稻品种POD酶谱变化及与性状的关系，采用蛋白质复性电泳技术对离子束诱变的水稻新品种玉稻518及亲本在灌浆期的POD酶谱动态变化进行了研究，旨在发现离子束诱变引起的水稻灌浆期酶谱的变化情况，以及与变异性状间的关系，为水稻离子束诱变育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

2004年对亲本新稻03518(用A表示)进行离子束诱变，经多代自交选育得到稳定遗传的新品系M 03518，于2015年通过国家农作物品种审定委员会审定(国审稻2015044)，品种名：玉稻518(用B表示)。

1.2 方 法

1.2.1 样品制备

实验材料统一于2017年5月1日育秧，6月3日移栽于土壤肥力一致的同一试验田(河南师范大学生物试验田)，田间管理按常规大田措施。待水稻生长至灌浆期分3次取样，分别在灌浆前期、中期、后期。每个样品设置3个重复，每个重复选5株，每株取倒2叶片，迅速置于冰盒中带回实验室。用去离子水冲洗干净，吸干水，去除叶脉后保留中间1 cm叶片，5份剪碎混合称量相同鲜重，置于预冷研钵中液氮充分研磨，然后加入4倍体积(W/V=1/4)提取液(0.9% NaCl溶液)继续研磨至匀浆液，转移至离心管冰浴浸取5 min，4 ℃离心(10 000r/min)10 min，取上清液分装到200μL离心管中，-20 ℃保存备用，以上操作均在4 ℃环境进行。

1.2.2 复性电泳

复性电泳技术(SDS-G-PAGE)[13]采用过饱和SDS与蛋白质结合发生可逆变性，然后进行电泳，电泳后用非离子去垢剂洗去与蛋白质结合的SDS，使其恢复活性。然后用联苯胺染色，便可直观的分析POD酶谱变化。

聚丙烯酰胺凝胶复性电泳按照Neuhaus-Steinmetz等[13]的方法(略有改动)，电泳采用10%分离胶和5%浓缩胶，样品制备液中加入活性样品缓冲液，混匀备用。每泳道上样量为30μL。电泳按照Heussen等[14]和徐存栓[15]等的方法，浓缩胶电压≤80 V，电流≤20 mA，分离胶电压≤120 V，电流≤20 mA，-4 ℃环境电泳。当溴酚蓝距离分离胶下沿1～2 cm时停止电泳，取出分离胶，切除溴酚蓝以下部分，放入250 mL洗涤液(TritonX-100 12 mL，Tris-base 3.03 g，加双蒸水500 mL，调pH=7.0)洗涤30 min，再用双蒸水洗涤3次，每次5 min。

1.2.3 染色及照相

采用联苯胺染色法(双蒸水200 mL+联苯胺母液20 mL+1.5 M醋酸钠10 mL+1.5 M醋酸10 mL，3%的H2O220 mL，现用现配)进行染色，条带清晰后立即拍照。由于酶活有差异，本实验分2次拍照，即着色速度快的酶带清晰时第1次拍照，继续染色至其它酶带清晰时第2次拍照。然后，将胶板保存于7%乙酸中或制成干胶。标准蛋白泳道在洗涤前单独切下，固定，考马斯亮蓝染色液染色，然后脱色，照相。

1.2.4 酶谱分析

利用Gel Pro软件(美国Media Cybernetics公司)标注分析各泳道酶带分子量和酶活。

1.3 主要试剂及配方

丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺贮存液：称取丙烯酰胺(Acry)150 g，甲叉双丙烯酰胺(Bir)4 g，加入2 g活性炭溶解1 h，过滤定容至500 mL，4 ℃保存。

1.5 M Tris-HCl(pH=8.8)：三羟甲基氨基甲烷36.28 g，SDS 0.8 g，盐酸调pH至8.8，定容至200 mL。

0.5 M Tris-HCl(pH=6.8)：三羟甲基氨基甲烷12.11 g，SDS 0.8 g，盐酸调pH至6.8，定容至200 mL。

电极缓冲液(10 X电极缓冲液)：Gly 72.2 g+Tris 15.41 g+SDS 5 g，溶解后双蒸水定容至500 mL保存备用，注意经常更换。

活性样品缓冲液(3 X样品缓冲液)：78%甘油20 mL，0.5 M Tris-HCl(pH=6.8)7 mL，SDS 10 g，双蒸水定容至200 mL。

固定液：甲醇250 mL，冰乙酸50 mL，双蒸水200 mL。

染色液：考玛斯亮蓝R 250 1.1 g，甲醇200 mL，冰乙酸50 mL，双蒸水250 mL。

脱色液：甲醇150 mL，冰乙酸50 mL，双蒸水300 mL。

洗涤液：TritionX-100 12 mL，Tris 3.03 g，完全溶解后调pH至7.0，定容500 mL。

联苯胺母液(10 x)：2 g联苯胺+100 mL无水乙醇，溶解后4 ℃保存备用。

标准蛋白Marker：245、180、135、100、75、63、48、35、25、20 kD。

注：A.新稻03518；B.玉稻518；1、2、3分别代表灌浆前期、中期、后期；M为标准蛋白Marker。下同。图1 玉稻518及亲本灌浆期叶片POD酶谱

图2 玉稻518及亲本灌浆期叶片300～100 kD区域POD酶谱(高酶活区显色早期放大图)

2 结 果

2.1 灌浆前期酶谱

由图1的A 1和B 1泳道可以看出，在灌浆前期，A 1、B 1中均检出300～100 kD酶活极强的带区，以及48、38、36、34、33、31 kD和27 kD等7条酶带，其中48 kD和36 kD酶活较强，其它酶带活性较弱；上述各酶带在A 1中酶活均高于B 1，两泳道总酶活A 1>B 1。B 1中还检出54 kD和42 kD 2条新酶带，活性较弱，A 1中未检出。由图2可知，在B 1中，检出185 kD新酶带，且活性较弱，A 1中未检出。A 1、B 1中均检出了245、100 kD 2条酶带，且100 kD酶活较245 kD强。

2.2 灌浆中期酶谱

由图1的A 2、B 2可以看出，灌浆中期均检出300～100 kD酶活极强带区，以及52、48、36、34、33、31 kD和27 kD等7条酶带，且各酶带活性B 2中均显著高于A 2。两泳道总酶活B 2>A 2。B 2中还检出53、42 kD和38 kD酶带，其酶活表现为38 kD>42 kD>53 kD，这3条酶带在A 2中未检出。从图2可以看出，B 2较A 2多检出1条245 kD酶带，且酶活强。

2.3 灌浆后期酶谱

灌浆后期酶谱见图1的A 3和B 3泳道所示，A 3、B 3中均检出300～100 kD活性极强酶带区，以及48、38、36、34、33、31 kD和27 kD等7条酶带；从酶活来看，B 3中各条酶带活性均强于A 3，两泳道总酶活B 3>A 3；A 3中48 kD和36 kD酶带活性强于同泳道及对应B 3泳道的其余5条酶带活性。B 3中检出54 kD和42 kD 2条新酶带，在A 3未检出；A 3中检出1条53 kD酶带，B 3未检出。

2.4 灌浆各时期酶谱

由图1和图2可以看出，整个灌浆期A和B叶片POD酶谱差异显著。B中灌浆前期和后期检出54 kD新酶带，在B的中期及A的整个灌浆期均未检出。B的灌浆各时期均检出42 kD新酶带，在A灌浆各时期均未检到。在A 3和B 2中检出1条53 kD酶带，该酶带在A和B的表达时期出现差异。由图2可以看出，仅在B 1中检出185 kD新酶带。

酶带活性上，各泳道总酶活由高到低依次为：B 2>B 3>A 1>A 3>B 1>A 2，可以看出A各泳道总酶活表现出灌浆前期强，中期弱，后期较强的特点；B各泳道的总酶活表现为灌浆前期弱，中、后期强的特点。38 kD酶活在B 2、B 3强，A 1稍强，其余泳道较弱；31 kD酶活在B 2强，B 3较强，其余泳道较弱；27 kD酶活在A 1、B 3中较强，其余泳道活性极弱；这3条酶带在不同时期活性变化较大。

3 讨 论

灌浆期水稻叶片生理活动旺盛，参与多种代谢活动的POD酶活和种类也发生显著的变化[16-19]。本研究发现，离子束诱变的水稻新品种玉稻518在灌浆期检出3条新酶带，包括灌浆前期检出的185 kD酶带，灌浆前期、后期检出的54 kD酶带和灌浆各时期均检出的42 kD酶带。因此推测，离子束可能诱导亲本新稻03518的基因发生了突变或调控水平发生了变化。Nakai等[20]通过热中子辐射处理水稻，获得一个抗白叶枯病几个菌系的突变体M41，进一步抗性鉴定获得一个新的抗病基因xa-nm(t),证明热中子辐照能诱导突变，产生新的抗性基因。吴跃进等[21-22]采用氮离子辐照籼稻9311，在M 2代中发现多个突变体，并通过基因定位确定一个新的可能控制水稻脆杆性状的基因tsbc1，证明离子束辐照能提供新的水稻突变体，对水稻基因组研究有一定作用。董喜存等[23]对碳离子诱变的早熟高粱突变体进行同工酶分析，发现突变体比野生型多了一条Rf值为0.65的酯酶同工酶带，推测是碳离子使甜高粱酯酶基因或者调控酯酶表达的基因发生了改变。这些研究与本研究中检出新酶带的结果相同，说明离子束可以诱导基因突变，引起后代的遗传性状改变。

从玉稻518和亲本的遗传性状可以看出：诱变后代的叶片在灌浆期表现出由下而上逐渐衰老，而亲本叶片的衰老过程不如诱变后代明显；在灌浆期诱变后代抗穗颈瘟，亲本中出现感穗颈瘟的情况，这说明诱变后代的抗瘟性较亲本提高。 玉稻518中出现的新酶带，可能直接影响了某些特异性状的表现。

在诱变后代玉稻518中，灌浆前期检出185 kD新酶带，中期、后期未检出；灌浆前期、后期检出54 kD新酶带，中期未检出。新酶带的阶段性出现可能与水稻灌浆期的生理活动变化有关。程家胜等[24]对苹果新梢前期生长过程中芽的POD同工酶进行分析，发现一个负极向扩散酶区的出现与消失跟芽的生长减缓或停止生长和叶片的衰老有关，认为POD同工酶与生长节奏和衰老存在一定关系。万文举等[25]对多个水稻抗瘟性品种和感病性品种的POD同工酶酶谱分析，发现在不同时期抗瘟性品种均比感病性品种多检出一条稳定表达的弱活性POD酶带，通过与感病品种的杂交验证，认为水稻的抗瘟性与该POD酶带有关。刘涛等[26]对水稻灌浆不同阶段蛋白质表达差异进行双向电泳分析，发现核酮糖二磷酸羧化酶大亚基的蛋白点在灌浆早期丰富，灌浆末期消失，认为该酶的表达与灌浆周期中功能变化相关。由此推测，185 kD酶带出现可能与前期某些生理功能的转变密切相关，54 kD酶带可能参与到水稻某个生育时期的调控进程中，42 kD酶带可能与变异后代抗稻瘟病能力提高密切相关。这3条新酶带(185、54 kD和42 kD)，究竟那条与水稻的抗瘟性相关？灌浆期生理功能的转变相关？是否共同作用于一种或几种生理过程？均有待进一步研究。

本研究发现，53 kD酶带在亲本新稻03518的灌浆后期表达，在诱变后代的灌浆中期便表达,即表达时期较亲本提前；从它们的遗传性状上看，诱变后代玉稻518的生育期较亲本新稻03518缩短3 d，说明诱变影响了后代玉稻518生育期相关基因的表达。王新望等[27]对陆地棉叶不同生育期的POD同工酶酶谱进行分析，发现熟期越早，该酶带出现得越早，认为部分POD同工酶带出现的早晚与品种成熟期相关。杨文等[28]对30个甘蔗品种的酯酶同工酶进行电泳分析，发现一些迁移率低的酶带与其开花早迟等性状相关，认为这些POD同工酶带与早熟性状相关。由此推测，本实验检出的53 kD酶带可能与水稻生育期相关。

亲本新稻03518仅在灌浆前、后期检出，中期缺失，而诱变后代玉稻518在灌浆各时期均检出245 kD和38 kD酶带，这说明诱变对基因不同时期的表达有影响。敖良德等[29]对苹果幼果发育过程的POD同工酶进行分析，发现受精后果柄中POD同工酶的酶带数在不同时期出现阶段性变化，认为酶带在某个阶段的消失与出现和基因阶段性表达相关。姬生栋等[30]对小麦生育前期绿叶中POD酶谱进行分析，发现不同阶段和环境下，叶片中POD种类和活性有显著变化，认为POD同工酶的表达变化，直接反映小麦体内某个生育期的代谢状况。因此推测诱变后代灌浆中期某些受抑制基因被重新激活表达，对该时期的生理活动(“源”与“库”通道建立、叶片光合效率、抗病性等)有一定影响。

诱变后代玉稻518在灌浆中、后期的总酶活较亲本显著提高，从玉稻518产量来看，其千粒重比亲本提高2.1 g，产量提高451 kg/hm2，这说明灌浆中、后期POD酶活高可能直接影响到籽粒的灌浆。张小冰等通过对60Co-γ辐照甜荞高产突变体的第三代种子下胚轴的POD同工酶分析，发现高产株的POD活性较对照组高2倍，认为高产株POD酶活与高产性状呈正相关[31]；蔡永萍等对灌浆期水稻剑叶POD酶活变化的分析发现叶片POD酶活高能保证较高的灌浆速率，后期延缓叶片衰老，得出POD酶活高能使籽粒干物质迅速积累的结果[32]。因此推测，诱变后代中、后期POD总酶活提高，是为了清除旺盛代谢活动产生的大量H2O2，维持功能叶片的活性。灌浆后期POD酶活高有利于物质的高效合成、分解和“源”与“库”之间物质的运输和积累。