甘薯半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（CPI）克隆及功能初步分析

洪子茜，杨秋萍，侯馨怡，邓 鸽，张 立，费雪婷，胡又文，雍 彬，邵欢欢

（四川师范大学 生命科学学院，四川 成都 610101）

植物蛋白酶抑制剂(protease inhibitors， PIs)是一类分子量较小的蛋白或多肽，PI可以与蛋白酶的变构部位或活性区域结合从而抑制蛋白酶活性，因此可以抑制食草类昆虫消化道中蛋白酶的活性，降低昆虫对植物的摄食量，影响昆虫的生长和发育，甚至可以导致昆虫的死亡，是参与植物防御机制的重要成分之一。PI在调节蛋白酶的活性以及蛋白质的代谢方面有着难以代替的作用，是生物体内免疫系统的重要组成部分，在植物储存淀粉等营养物质的器官（如块茎、种子、球茎等）中，PI含量甚至高达总蛋白的10%。目前通过现代分子分离技术已经从50多种植物材料获得蛋白酶抑制剂，其中以植物种子含量最多和最广泛。半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cysteine proteinase inhibtor，CPI）是PI中的一类重要的蛋白酶抑制剂，在动植物体内广泛存在，能够参与生命体内的多种生理生化反应，与巯基蛋白水解酶形成动态平衡。CPI参与调节各种生命活动，在植物的种子萌发、胚体发育、组织分化、细胞程序性死亡、防治虫害、果实成熟等方面具有重要的作用。此外，近年来有研究也发现CPI在植物抗逆胁迫方面也发挥了重要的作用，如，拟南芥中存在的两种半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatin）基因AtCYSa和AtCYSh在逆境环境下，如低温、干旱、盐、氧化胁迫下可以被诱导表达，且在酵母中过表达能提升酵母在胁迫环境下抗低温、盐、干旱、氧化胁迫能力。麻风树的JcCPI基因在大肠杆菌和烟草中进行异源过表达也可以提升其耐盐能力，而且转基因烟草中丙二醛含量更低，抗过氧化酶活力更高，这表明CPI可以通过影响过氧化物酶活性来降低非生物胁迫引起的次生氧化胁迫，最终提高植物对非生物胁迫的抗性和适应能力。目前，已经从拟南芥、玉米、番茄、麻风树、小麦等50多种植物中克隆得到了CPI基因，研究发现CPI蛋白在植物种子中的含量较多，CPI蛋白的序列保守性也非常强，而甘薯中的CPI蛋白目前尚未有相关报道。本研究采用RT-PCR从甘薯嫩叶组织中克隆得到CPI基因，构建表达载体转化大肠杆菌BL21对其抗逆能力进行了初步探索，使用多种生物信息学软件对其进行了分析，为未来深入研究甘薯CPI基因的功能打下了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

在自然条件下从大田中采集徐薯18的根、茎、叶等组织，采集后即清洗擦干，短期冻存在液氮中。克隆宿主菌株：大肠杆菌DH5ɑ，表达菌株大肠杆菌BL21，原核表达载体是pET-32a(+)。

1.1.1 主要工具酶与试剂 RNA提取所用Trizol及M-MLV逆转录酶购自Invitrogen 公司，DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司，M-MLV逆转录酶KOD-FX-Neo 酶购东洋纺公司，T4 DNA连接酶购自TAKARA公司，引物及测序由北京擎科新业生物技术有限公司进行。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取与RT-PCR 以徐薯18（四川省农科院生核所提供）各种组织为材料，液氮冷冻后用研钵磨碎成粉末后立刻使用Trizol进行总RNA提取，提取得到的RNA进行等比例混匀，总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定后取1μg RNA为模板，使用M-MLV反转录酶进行反转录，所有方法均按照Invitrogen 公司试剂盒的推荐方法完成。

1.2.2 甘薯CPI基因克隆及载体构建 以反转录得到的第一链cDNA为模板，IbCPI-F：5'-CG GGATCCATGGCTTTGGGAGGCGTTAC-3'和IbCPI-R：5'-CCCAAGCTTTTAAACACTGA CACTAGAGATGCCA-3'为引物，使用KODPlus-Neo（1 U/μL）高保真酶进行PCR，PCR反应条件为：94℃预变性2分钟，98℃变性10秒，56℃退火5秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃延伸8分钟。PCR产物进行胶回收，纯化后的PCR产物及pET-32a(+)载体分别使用BamH I和Hind III进行双酶切，酶切产物经胶回收后使用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑选4个阳性克隆并送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，测序正确的菌株提取质粒并转化大肠杆菌BL21感受态细胞用于后续实验。

1.2.3 序列分析 根据甘薯CPI基因测序结果，使用BLAST和DNAman软件进行基因及蛋白序列同源比对，利用ProtParam分析IbCPI蛋白的理化性质包括：相对分子质量、氨基酸组成、等电点(pI)、半衰期、不稳定系数、总平均亲水性等，使用NPS@和Swiss-model进行IbCPI蛋白的二级和三级蛋白结构分析，利用TMpred、Wolf psort、NetPhos 3.1、SignalP 4.1 Server等软件分别进行跨膜结构、亚细胞定位、磷酸化位点和信号肽等分析，使用MEGA5.0对其他10个物种的CPI蛋白与甘薯CPI蛋白进行聚类分析，将甘薯CPI蛋白提交至STRING分析能与甘薯CPI蛋白发生互作的潜在蛋白。

1.2.4 重组菌株的胁迫处理 将重组菌和对照菌株（空载体）分别置于2mL LB（含有50μg/mL Amp）液体培养基中过夜培养，将其接入10mL液体LB中当OD600为0.6时，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导培养4小时。取此培养液分别移入含有Amp的LB培养基和30%PEG6000的LB培养基中进行37℃振荡培养，分别进行无胁迫培养和干旱胁迫；另取培养液接入含有Amp的LB培养基中放置于45℃培养箱中进行振荡培养，对重组菌株进行高温胁迫。对无胁迫培养每隔2小时进行取样及利用紫外分光光度仪测定OD600值，对胁迫培养每隔4h取样并测定OD600值，实验均重复3次，最终绘制生长曲线。

图1 CPI基因PCR产物电泳图M：DL5000 Maker；1：以甘薯CPI基因PCR产物Fig.1 Agarose electrophoresis analysis of IbCPI RT-PCR productsM：DL5000 Maker；lane 1： IbCPI gene PCR product of sweet potato

2 结果与分析

2.1 目的基因扩增及表达载体构建

以提取得到的徐薯18嫩叶总RNA为模板，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit进行反转录，以反转录产物为模板进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现在350bp左右出现一明显条带，大小与预期片段大小基本一致，PCR产物胶回收后与pET-32a(+)载体分别进行BamHI和HindIII双酶切，使用DNA连接酶过夜连接，连接产物转化大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆PCR验证后送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

2.2 IbCPI蛋白质序列分析

测序结果显示甘薯CPI基因长度为345bp，其翻译的蛋白长度为114aa，使用Protparam软件、对甘薯CPI蛋白进行理化性质分析，甘薯CPI蛋白分子式为C564H894N142O176S1，分子量为12.51 kDa，理论等电点4.83，不稳定系数是30.59，因此是一个稳定的蛋白质，脂肪系数为89.74，亲水性值为-0.302，因此甘薯CPI是一个亲水性蛋白。通过BLAST软件搜寻与IbCPI蛋白同源序列，甘薯CPI蛋白与Ipomoea nil、Ziziphus jujuba、Jatropha curcas、Sesamum indicum的CPI蛋白的序列相似度分别是86.96%、58.26%、55.65%、55.65%。C P I蛋白具有非常保守的活性位点区域，甘薯CPI蛋白也具有类似的保守序列，在其第48-52位氨基酸含有活性位点基序Q-X-V-XG(Q48-V49-V50-A51-G52)。

图2 IbCPI与其他植物CPI全长蛋白序列比对Fig.2 Alignment of IbCPI with cystatins from other plant speciesbased on the full-length amino acid sequence.

2.3 IbCPI蛋白质生物信息学分析

使用TMpred软件进行跨膜结构分析，发现甘薯CPI没有明显的跨膜区域结构。SignalP 4.1 Server预测结果发现甘薯CPI蛋白可能没有信号肽，因此可能是一种胞内蛋白，亚细胞定位软件Wolf psort对甘薯CPI蛋白在甘薯细胞内的位置进行了预测，结果发现K最近邻(k-Nearest Neighbor，KNN)值为14，其中8个位于细胞质中，3个位于叶绿体中，3个位于胞外，即甘薯CPI定位可能性为：细胞质＞叶绿体＞胞外。NetPhos 3.1分析结果表明甘薯CPI蛋白可能具有7个磷酸化位点，其中有2个Serine位点（Pos13、Pos18），1个Threonine位点（Pos7），3个Tyrosine位点（Pos8、Pos19、Pos23），这表明IbCPI可能可能受多种蛋白激酶的磷酸化和去磷酸化所调控， 参与各种细胞调控过程。

2.3.1 蛋白质结构预测 使用NPS@软件对IbCPI蛋白进行二级结构预测，结果发现其中α-螺旋有24个（21.05%）氨基酸，β-折叠有34个（29.82%）氨基酸，无规则卷曲有54个（47.37%）氨基酸，模糊状态有2个（1.75%）氨基酸。利用 Swiss Model数据库预测了甘薯CPI蛋白的三维结构，通过数据库序列搜索得到最适模板4tx4.1.B（Cysteine proteinase inhibitor of Vigna unguiculata），其序列相似度为67.47%，可以作为模板进行同源建模，得到甘薯CPI蛋白的三维结构模型（如图3所示）。

图3 IbCPI的三维结构Fig.3Three-dimensional structure of IbCPI

2.3.2 蛋白互作分析 使用STRING蛋白互作网络分析，以Solanum lycopersicum的CPI蛋白为模板构建甘薯CPI的蛋白作用网络，筛选最小相互作用分值为0.4，结果发现该蛋白可能与5个相关蛋白（TUB、F35H、ELF4、56B23-g6、Pro1）可以发生相互作用（如图4所示），但是这些相互作用的具体调控模式目前尚不清楚。

图4 甘薯CPI蛋白相互作用网络分析Fig.4 Protein-protein interaction analysis of IbCPI

2.4 进化树分析

进化树分析是使用MEGA5.0软件的邻接归并法(Neighbor-Joining法)构建，bootstrap 自检重复1000次。利用NCBI数据库中的Blast 软件将甘薯CPI基因编码的氨基酸序列与GenBank中的氨基酸序列进行比对和相似性搜索。结果表明，克隆得到的甘薯CPI蛋白与Ipomoea nil的CPI蛋白的亲缘关系最近，这与甘薯的物种分类情况也较为一致。

图5 甘薯CPI蛋白进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree of IbCPI

2.5 重组菌对胁迫的耐受性研究

2.5.1 无胁迫生长 由图6可知，在无胁迫条件下，含有IbCPI基因的菌体与对照菌株（含有空载体）的生长趋势基本一致，这表明过表达IbCPI基因对大肠杆菌的生长几乎没有影响。

2.5.2 干旱胁迫 使用30%PEG6000对大肠杆菌进行干旱胁迫，结果发现（图7）含有目的基因的重组菌株的迟滞期在20小时左右，而对照菌株则为32小时，而且相比对照菌株，重组菌株的生长更具优势，过表达IbCPI有利于大肠杆菌菌株在干旱胁迫下生长。

2.5.3 高温胁迫 将重组菌株和对照菌株均在45℃进行振荡培养，对其进行高温胁迫，由图8可以看出，相比无胁迫对照菌株和重组菌株在高温胁迫下生长速度都明显下降，但是含有甘薯CPI基因的菌株生长效果明显优于对照菌株，这表明过表达甘薯CPI基因有助于提升大肠杆菌的耐高温能力。

图8 重组菌在45℃的LB培养基中的生长曲线Fig.8 Growth curves of recombinant bacteria in LB medium at 45℃

3 讨论

甘薯又名甜薯，旋花科植物，属喜光的短日照作物，是世界第六大粮食作物，在我国为第四大粮食作物，淀粉含量高、产量高、应用前景广阔。随着当前自然环境的恶化，各种非生物胁迫如干旱、盐、碱以及重金属等环境压力的增加日益影响植物的生长和发育，但甘薯表现出了其特有的抗逆特性，能够一定程度上地抵御外界环境带来的生存压力。因此，对甘薯相关抗逆基因的研究，对作物的抗胁迫性质能力的改善，以及对提高经济作物的产量有着重要的意义。植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂是重要的组织防御应激蛋白，同时参与植物生长发育的相关调节，在植物的抗逆胁迫中也起到了重要的作用。本研究通过RT-PCR技术克隆得到甘薯全长CPI基因，生物信息学分析发现IbCPI蛋白也具有保守的 Q-X-V-X-G(Q48-V49-V50-A51-G52)结构，三级结构与其他CPI蛋白类似都具有3个β-折叠和1个α-螺旋结构，IbCPI蛋白可能与TUB、F35H、ELF4、56B23-g6、Pro1等蛋白能够发生作用，但是目前的作用机制尚不清楚。将IbCPI基因插入原核表达载体pET-32a(+)中，转化大肠杆菌BL21，以IPTG诱导重组蛋白的过表达，在高温和干旱胁迫下发现重组菌株比对照菌株具有更短的迟滞期且生长效果更佳，这表明IbCPI基因可能具有提升细胞的抗逆胁迫的能力，这为未来深入研究IbCPI基因的功能及提升甘薯的产量具有一定的意义。