转基因抗虫棉的研究现状及发展趋势

常淑芬

【摘 要】长期以来，棉花深受虫害影响，导致棉花减产。随着分子生物学及重组DNA技术的迅速发展，利用基因工程技术将外源杀虫基因导入棉花获得转基因抗虫棉已成为解决棉花虫害的手段之一。本文综述了常用外源杀虫基因的种类、杀虫机理及在生产实践中的应用，并探讨了抗虫棉遇到的一些问题及今后的发展趋势。

【关键词】基因工程；抗虫棉；抗虫基因；研究进展

【中图分类号】S332.3 【文献标识码】A

【文章编号】2095-3089（2018）22-0048-02

棉花不仅是一种重要的纺织原料，也是一种重要的经济作物。长期以来棉花深受棉铃虫、棉红铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、蚜虫等多种害虫的侵害，其中以棉铃虫等鳞翅目害虫的危害最为严重。据调查显示上世纪90年代，棉铃虫连年爆发，每年给国家造成的经济损失多达几十亿甚至几百亿。已成为限制棉花生产的重要因素。为了有效地防治棉铃虫等害虫，通过各种技术手段培育抗虫棉具有重要意义。其中利用基因工程培育转基因抗虫棉是目前解决棉花虫害的一种主要方法。

一、常用的外源杀虫基因

一些微生物或动植物体内能产生杀死昆虫的毒蛋白，将这些毒蛋白基因导入到棉花中，可赋予棉花抗虫性。按导入的外源杀虫蛋白基因分类，转基因抗虫棉有Bt抗虫棉、蛋白酶抑制剂抗虫棉、外源凝集素抗虫棉等。目前，在生产中应用最多的主要是Bt抗蟲棉。

1.苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因（Bt基因）。

苏云金芽孢杆菌是一类广泛存在于自然界的革兰氏阳性菌，代谢过程中能产生杀虫晶体蛋白、δ-外毒素、β-外毒素等，主要对鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、直翅目等害虫有毒害作用，研究还发现Bt对寄生线虫、绦虫等也有影响，但对人畜无毒害作用，因此在有害生物的治理中起着非常重要的作用。

2.蛋白酶抑制剂基因。

蛋白酶抑制剂在植物中广泛存在，尤其在植物的种子中含量丰富，约占植物总蛋白的10%。迄今为止，蛋白酶抑制剂根据作用酶的活性位点的不同和氨基酸序列的同源性，分为4类：丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂分为Bowman-birk型、Kunitz型、PI-I型、PI-II型等，其中Bowman-birk型中的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI）和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因（SKTI）对鳞翅目、鞘翅目、直翅目等多数农田害虫都有毒杀作用，在转基因应用中最为广泛。其杀虫机理是：CpTI能与害虫消化道内的蛋白消化酶紧密结合形成酶-抑制复合物，使害虫体内的蛋白消化酶被抑制，当害虫取食转CpTI的植物时，就会抑制生长和发育，甚至死亡；同时，当CpTI与害虫体内的蛋白消化酶结合后，会导致害虫体内蛋白酶的过量分泌，经过神经系统的反馈调节，使害虫产生厌食反应。上述双重效应将减少昆虫对植物蛋白的摄取及利用率，最终造成昆虫因缺少必要的蛋白质而停止发育甚至死亡[3]。由于CpTI对人畜没有毒害作用，因而在转基因中有很好的应用前景。

3.外源凝集素基因。

外源凝集素是一类能特异识别并可逆地结合单糖或寡糖的蛋白或糖蛋白。在植物各组织器官中均有发现，尤以豆科植物的种子中含量最为丰富。目前人们已分离出多种外源凝集素，但大多数外源凝集素因对高等动物有毒害作用，从而限制了它们在基因工程方面的应用。其中雪花莲凝集素基因（GNA）对刺吸式和咀嚼式害虫有毒性，可以抑制害虫的生长甚至抑制其繁殖力，并且对其天敌、人畜等无害，在植物抗虫基因工程方面正日益受到重视。

4.新型抗虫基因。

除以上几种主要的抗虫基因外，昆虫神经毒素、淀粉酶抑制剂、几丁质酶基因、阴离子过氧化物酶基因、核糖体失活蛋白基因、脂肪氧化酶基因等一些新的抗虫基因正在被研究。

二、转基因抗虫棉存在的问题

尽管转基因抗虫棉在控制害虫方面取得了很大的进展，但在生产实践中仍存在一些局限性，在实践中也遇到了一些问题。

1. 抗虫谱较窄，害虫易产生抗性。

危害棉花的害虫有几百种，其中主要以棉铃虫、棉蚜、棉叶螨、斜纹夜蛾、棉红铃虫的危害最为严重。目前世界各国培育和应用的大多是Bt转基因棉，这种抗虫棉仅对棉铃虫、棉红铃虫等极少数鳞翅目害虫有抗性，对其他害虫不具有抗性。相反还增加了其他害虫的发生率，使一些次要害虫上升为主要的害虫。Wu等的研究表明，Bt转基因棉虽然减少了棉铃虫的数量，但是并没有减少蚜虫、盲蝽蟓等害虫的数量，Men等的研究则表明，Bt棉田的次要害虫盲蝽蟓可能比非转基因棉田的数量多。目前由于昆虫动态数量的变化而导致次要害虫对棉花生产所造成的损失已成为普遍现象，因此要不断地研发抗虫范围更广的抗虫基因，培育广谱性更强的抗虫棉。

2. 外源抗虫基因在棉花受害部位表达量低。

在目前转基因植物中，驱动外源抗虫基因在植物体内的表达多采用组成型启动子，如CaMV35S启动子，使目的基因在植物体内各部位平均表达，难以在受侵害部位形成较高的作用浓度，害虫在长期的选择压下提高了对转基因植物产生的抗性几率。因此有必要研究使外源抗虫基因在转基因植物体内特定的时间及特定的部位高效表达的方法。

3.转基因抗虫棉的Bt毒蛋白表达的时空性。

（1）转基因抗虫棉的Bt毒蛋白表达具有时间性。

研究发现，随着棉株的生长、发育、生殖组织出现、成熟、衰老，Bt毒蛋白的表达呈下降趋势，即前期抗虫性强，后期抗虫性弱；而棉铃虫危害较严重的时期正处于棉花生长阶段的后期。因此，抗虫棉种植的后期应适当地进行化学防治，并结合生物防治，以降低虫害。

（2）转基因抗虫棉的Bt毒蛋白表达具有空间性。

即：棉株不同组织器官抗虫性能存在差异，一般是营养器官高于生殖器官，其抗性顺序为功能叶>嫩顶叶>蕾>花。此顺序也间接表明棉铃虫对转基因棉花的为害有位置效应。因此转Bt毒蛋白的抗虫棉在开花和成蕾期要结合化学防治，治理害虫。

4.标记基因的安全性。

目前，常用的标记基因是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，在转基因棉花中常用的标记基因是nptⅡ基因。虽然，nptⅡ基因已通过安全评价，但是其他标记基因的使用可能对生态环境和人类健康等存在潜在的威胁，例如一些抗除草剂基因可以通过花粉、种子等传播途径与近缘野生种杂交，使近缘野生种获得抗除草剂基因，若近缘野生种本身就是杂草，那么就有可能变为难以控制的“超级杂草”，还可能导致遗传基因多样性的丢失。另外，标记基因及其产物还可能会影响人或动物的健康。

5.转基因抗虫棉易出现早衰、枯萎病、黄萎病。

转基因抗虫棉在一定程度上实现了防治害虫的目的，棉铃脱落也大大减少，棉铃成铃高峰期提前，但早熟的同时，由于体内大量的养分被消耗掉，会出现早衰。抗虫棉发育过早，开花结铃盛期提前，因此，伏桃和早秋桃结铃比例较少，早伏桃相对比例就会增加，造成抗虫棉早衰。

三、转基因抗虫棉的发展趋势

1.增强抗虫基因的抗性，减缓昆虫的耐受性。

（1）优化并联合使用多价基因。

对天然抗虫基因密码子进行优化改造，在一定程度上能提高对昆虫的抗性。田颖川等采用定点突变法对雪花莲凝集素（GNA）进行了遗传修饰，将其含有的稀有密码子改造成植物常用密码子，修饰后的GNA转基因棉花与对照相比对棉蚜有很好的抑制作用。

（2）RNAi技术。

近来，有研究报道，RNAi技术对控制苹果浅褐卷叶蛾、吸血椿象、白蚁等多種农业害虫有很好的效果。目前，利用RNAi技术防治害虫还处在试验阶段，但利用RNAi技术防治害虫将是值得探讨的一条路。

（3）“高剂量或庇护所”（high dose/refuge）策略。

高剂量或庇护所是将转基因植物与非转基因植物混种，种植的转基因植物能够高效表达抗虫毒素杀死杂合或纯合的抗性害虫。而敏感害虫能在非转基因植物（“庇护所”）上繁殖，这样通过敏感害虫与抗性害虫的随机交配可以达到“稀释”抗性害虫的抗性基因。

2.采用诱导型、组织特异性的启动子提高外源抗虫基因的表达量。

组织特异性启动子，可以使外源抗虫基因仅在植物的花、生长点、蕾、叶、铃等特定部位高效表达，减缓害虫对外源抗虫基因产生抗性。损伤诱导型启动子，当害虫取食植株时，植株受到损伤，该启动子驱动外源抗虫基因表达，大量合成杀虫蛋白，在植株受到损伤时杀虫蛋白在受害部位瞬间大量表达杀虫蛋白，能更有效地杀死害虫。这种启动子应该对害虫的为害产生高度反应，或者正好在害虫为害前由诱导因子加以调控，使抗虫基因只有在受到害虫侵袭时，仅在被害虫侵袭部位高效表达。这在一定程度上可以降低对害虫的选择压力，延缓转基因作物的抗性寿命。目前，国内外对启动子的研究还远远不能满足农业生产的需求，应不断探索更多用于抗虫基因的特异启动子以增强转基因抗虫棉的表达效果。利用时间和空间特异性启动子，确保外源杀虫蛋白在特定时间和空间条件下表达。当害虫危害棉花时，棉花植株受到伤害，诱导启动子高效表达，合成外源杀虫蛋白，在损伤部位瞬间高效表达，从而更有效地防治害虫。

3.标记基因的安全性策略。

为了避免标记基因带来的安全性问题，近年来在标记基因的使用和选择方面有了新的进展。

例如，无选择标记基因的安全技术，该技术是利用分离剔除和重组剔除等方法将选择标记基因在转基因植物后代剔除。目前该技术已在拟南芥、烟草、玉米、水稻等作物中获得了成功。将该技术应用于烟草，可使外源基因的删除效率达100%，但该技术在大田条件下是否有如此高的删除效率有待进一步的验证[46-47]。而将该技术应用于转基因棉花生产中将是未来几年需要解决的问题。此外，开发新的安全标记基因，例如绿色荧光蛋白基因（gfp）[48]、叶绿素生物合成酶基因（HemL）[49]、葡萄糖苷酶基因（gus）、异戊稀转移酶基因（Ipt）[50]等，这些基因不产生抗生素和除草剂抗性，避免了标记基因引起的转基因植物的安全性问题。

4.进一步提高转基因棉花的产量。

Bt转基因棉花能够杀死害虫，但无法提高棉花的产量。我国于2005年成功地选育出了三系杂交抗虫棉新品种“银棉2号”，这是我国第一个通过国家审定的比常规育种抗虫棉增产26.4%的新品种。并且同时培育了转抗虫基因三系杂交棉常规育种与分子育种相结合的一种新体系，该体系不仅实现了棉花的高产、高效，而且成本低。因此，转基因抗虫杂交棉对于实现棉花的高产，优质具有重要意义。

四、展望

综上所述，转基因抗虫棉不仅在害虫防治方面起到了一定的作用，还避免了化学杀虫剂对环境和生态系统的破坏，但是目前应用于生产中的抗虫棉大多数仍是Bt棉，随之而来也产生了一些新的问题，例如：抗虫范围狭窄、害虫易产生抗性、一些次要害虫转变为主要害虫等。许多工作正致力于研究其新型抗虫基因、特异性启动子等，为培育出优质广谱性，抗性更持久的抗虫棉奠定基础，但关于一些抗虫基因的杀虫机理、对人畜、天敌有无毒性等目前还不是很清楚，因此，深入研究并培育出持久性双价抗虫棉或既抗鳞翅目又抗同翅目害虫的多价抗虫棉，且品质优良，高产早熟的新品种，是抗虫棉的发展趋势。而开发新的标记基因，提高转基因棉的安全性也是今后应关注的重点内容。

参考文献

[1] HOFTE H and Whiteley H R.Insecticidal Crystal Proteins of Bacilllus thuringiensis[J].MicrobiolRev，1989，53（2）：242- 255.

[2] 郭三堆，洪朝阳，徐琼芳，等.苏云金芽孢杆菌aiziwai7-29δ-内毒素基因改造后的杀虫活性研究[J].中国农业科学，1993，26（25）：77-81.

[3] 高越峰，朱祯，朱玉，等.大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及其转基因烟草抗虫性初探[J].高技术通讯，1997，9：5–9.

[4]高越峰，朱祯，肖桂芳，等.大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用[J].植物学报，1998，40（5）：405-411.

[5]高越峰， 朱 祯， 肖桂芳， 等. 大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用[J]. 植物学报， 1998， 40（5）： 405-411.

[6]吴志平， 徐步进. 转基因植物释放后在环境中成为杂草的风险性[J]. 生物工程进展， 1999， 19（1）： 9-13.