九站地区根际土壤高效解磷菌的筛选及分类鉴定

张梦坤 张欣 周星 孙亚静

【摘 要】 采用无机磷固体培养基从九站地区实验田玉米根际土壤中分离筛选出一株高效解磷菌jl-3，在无机磷固体培养基中，初始pH值为7.0，温度30℃培养3天，通过对其进行形态学观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，鉴定其为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）。无机磷液体培养基培养利用磷钼蓝比色法测得在第6天时可溶性磷含量最多。

【关键词】 九站地区；解磷菌；解磷能力；阴沟肠杆菌

[Abstract] The inorganic phosphorus solid medium from nine station area field separation in maize rhizosphere， an efficient phosphate-solubilizing bacteria jl - 3， in the inorganic phosphorus in the solid medium， the initial pH value of 7.0， temperature 30 ℃ training three days， through carries on the morphology observation， physiological and biochemical test and molecular biology identification， identification of the sewer enterobacteriaceae （Enterobacter cloacae）. Phosphorus molybdenum blue colorimetry was used to determine the most soluble phosphorus content in the 6th day.

[Key words] nine stations； phosphate-solubilizing bacteria； phosphorus removal capacity； enterobacter cloacae

磷是植物生长发育的重要物质基础[1]。土壤中平均含磷量只有0.05%，只有0.1%能被植物吸收，我国74%耕地土壤缺乏有效磷，所以土壤有效磷的缺乏是限制植物生長的主要因素之一[2，3]。解磷微生物是一类能够将植物难以吸收的磷转化为可利用状态的微生物。磷是许多发展中国家农业生产重要的限制因素，提高土壤中磷的利用效率将具有战略性意义[4-6]。不同的作物其根际分布的解磷菌种群也有差异[7]，东北地区的玉米产量占全国40%以上。本研究结合当地实际土壤情况和解磷菌的重要作用，拟从当地玉米根际土壤样品中分离出筛选出高效解磷菌，并对其进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定，为后期培养参数研究、解磷的条件优化及复合菌剂的开发提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

土样：九站地区玉米根际土样。

1.2 培养基

LB液体培养基：胰蛋白胨 10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠20.0g，蒸馏水1000mL，pH：7.0。

无机磷固体培养基：葡萄糖10.0g，琼脂15.0g，七水硫酸镁0.25g，磷酸钙10.0g氯化镁5.0g，氯化钾0.3g，硫酸铵0.5g，七水硫酸铁0.03g，四水硫酸锰0.03g，蒸馏水1000mL，pH：7.0。

无机磷液体培养基：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化镁5.0g，氯化钾0.3g，七水硫酸镁0.25g，四水硫酸锰0.03g，磷酸钙10.0g，蒸馏水1000mL，pH：7.0。

1.3 试验方法

（1）富集培养：从玉米根际取1g土样加入到100mL LB液体培养基中，在恒温摇床中以初始pH值为7.0、温度30℃、160r/min培养72h。

（2）菌株初筛：吸取1mL富集培养液，用无菌水进行梯度稀释，将10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9度的稀释液各取100μL，涂布于无机磷培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养5d。挑选溶磷圈明显的菌落进一步分离分化，取菌落长势良好、形态稳定的菌株。

（3）菌株复筛：将初筛得到的出发菌株接入到无机磷液体培养基，装液量100mL/250mL，置于摇床并以30℃、160r/min培养，测定可溶性磷含量。对解磷能力较强的菌株进行编号，再经富集、驯化后，得到一株解磷能力强的菌株编号为jl-3。

（4）菌种的鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》进行逐步分析鉴定。观察记录菌株的生长状况、菌落特征、菌体形态结构，并进行革兰氏染色、半固体试验、需氧性试验、葡萄糖发酵试验、乳糖发酵试验等生理生化鉴定，实验操作方法参照《常见细菌系统鉴定手册》完成。16s rDNA测序由上海生工生物工程有限公司完成。

（5）可溶性磷含量测定：采用磷钼蓝比色法，以相应的去离子水为参比液进行对照，利用分光光度计在660nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 菌株jl-3的鉴定

（1）生理生化鉴定

菌落形态为圆形，乳黄色，不易挑起。菌体呈杆状，有鞭毛。菌株jl-3为革兰氏阴性菌，半固体培养呈阳性，需氧性为兼性厌氧，葡萄糖发酵呈阳性，乳糖发酵呈阴性，产气呈阳性，淀粉水解呈阴性，见表1。

（2）分子生物学鉴定

16SrDNA序列分析法对菌株jl-3进行鉴定，通过提取DNA、PCR扩增、PCR产物测得到16SrDNA序列信息。利用BLAST程序进行同源性比对，检索同源性高的菌株，并通过建立系统发育树进行分析，结果见图1、图2。

（3）可溶性磷含量分析

由图3可知，接种后培养液中有效磷含量快速上升，在第6天时到达峰值，随后开始下降，第8天以

后开始保持稳定。

3 结论

本研究从九站地区玉米根际土壤分离得到一株高效解磷菌jl-3，通过形态学观察、生理生化试验并结合系统发育树分析，鉴定该菌株为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）。在30℃、pH=7的条件下该菌株具有较强的解磷能力，可为后期进行参数研究、解磷的条件优化及复合菌剂的开发提供一定的理论基础。

参考文献：

[1] 张巍，冯玉杰，胡纯国，等.耐盐碱解磷菌的分离鉴定及解磷 能力研究[J].土壤通报，2009，40（03）：572-575.

[2] 冯月红，姚拓，龙瑞军.土壤解磷菌研究进展[J].草原与草坪， 2003（01）：3-7.

[3] 刘盼，赵华，林广修，等.解磷菌的筛选及培养基成分对解磷 能力的影响[J].天津科技大学学报，2015，30（06）：17-22.

[4] 刘小玉，付登强，贾效成，等.油茶根际土壤解磷菌的筛选、 鉴定及培养条件[J].西南农业学报，2016，29（11）：2637-2642.

[5] 刘露，李丽，闫洪雪，等.一株高效解磷菌的筛选、鉴定及解 磷特性研究[J].山东农业科学，2016，48（11）：69-71+75.

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[7] 张晶晶，李建贵，郭艺鹏，等.新疆核桃根际土壤中解磷菌的 分离筛选及鉴定[J].经济林研究，2015，33（02）：57-62.