BDNF对缺糖缺氧小鼠mPFC脑区GFAP蛋白的影响

喻晓路

徐州医科大学江苏省麻醉学重点实验室，江苏徐州 221004

星形胶质细胞(astrocyte,AS)是中枢神经系统中数目最多的一种细胞,它作为胶质细胞的主要类别,几乎囊括了胶质细胞的所有功能[1]。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)被公认为是AS的标志性蛋白，在感染、创伤、神经退行性疾病等病理条件下，星形胶质细胞被激活，因此，抑制星形胶质细胞过度激活对防治中枢神经系统的疾病有重要意义[2]。BDNF(brain derived neu rotropic factor,脑源性神经生长因子)是一种重要的神经因子，在生理环境下具有促进突触的形成、维持神经系统的功能[3-6]。mPFC脑区是一个脑内与运动、学习记忆、情绪等功能关系密切的重要脑区，其中就包括神经元和胶质细胞[7]。脑组织的缺糖缺氧是脑缺血患者的主要症状之一，其中脑组织中的星形胶质细胞会大量增生，是一种缺血后的全脑保护性防御机制[8]。该次对比了脑片培养技术和细胞培养技术，认为脑片培养技术与细胞培养技术相比更多的保留了细胞和组织结构，能够更好的模拟生理状态，并且操作更简便，对实验设备的要求也不高[9-10]。该实验采用脑片培养的方法，目前此方法已经成熟，见图1，图中神经元形态清晰。该实验在2017年12月—2018年2月期间在徐州医科大学麻醉学重点实验室将18只小鼠随机分为3组，对小鼠mPFC脑区的脑片进行缺糖缺氧处理和复灌，并与加入BDNF的处理组进行比较，对GFAP蛋白的表达量进行测定，明确BDNF在缺糖缺氧条件下小鼠mPFC脑区的作用，为脑缺血病患所进行溶栓治疗的方法提供有力的实验依据。

图1 脑片培养mPFC脑区HE染色20X

1 材料与方法

1.1 主要材料

SPF级昆明小鼠18只，体重25～30 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，标准化饲养。

1.2 仪器和试剂

材料：BDNF（2837）购自 TOCRIS 公司，RIPA 裂解液（KGP702-100）购自凯基生物公司，低糖DMEM培养基（ABB210359）和 EBSS 培养基（AB10134597）均购自 Hy-Clone公司，青链霉素混合液（VC2003）购自VICMED公司，GFAP （12389）一抗购自 Cell Signaling Technology公司，GAPDH（10494）一抗购自 proteintech公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（A0208）和BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0009）购自碧云天生物技术有限公司，ECL发光试剂盒 （AC36131）购自bioworld公司，Transwell 24孔板细胞培养小室（3413）购自Corning公司，PVDF膜（IPVH00010）购自Immobilon公司，自动震动切片机购自莱卡公司，化学发光仪购自BIO-RAD公司，其余自配液体试剂均购自sigma公司。

自配溶液：高渗糖溶液Sucrose 254 mM,D-Glucose 10 mM,NaH2PO41.25 mM,NaHCO324 mM,MgSO4·7H2O 2 mM,KCl 3 mM,CaCl2·2H2O 2 mM，用去离子水溶解。使用前通入95%O2+5%CO230 min。

1.3 实验方法

1.2.1 脑片制备 实验动物经七氟烷诱导麻醉后，迅速断头，然后用剪刀剪开两耳间的皮肤直至两鼻间，然后翻转皮肤，暴露颅骨。用眼科剪去掉小鼠颅骨，暴露全脑。随后用眼科镊伸入脑前端下部的嗅球处，轻轻挑起脑的前端，剪断脑神经，翻转全脑，放入冰冷、预先通95%O2+5%CO2混合气 30 min的高渗糖溶液中，放置1～2 min。取出全脑，除去小脑和嗅球，用刀片切取鼠脑前中部，迅速用502胶水将脑组织块底部粘在自动震动切片机的缓冲槽中，用高渗糖溶液浸没组织块，设置自动震动切片机的切片速度、厚度和距离，切取含有mPFC脑区的厚度为300 μm的脑片，大约可以取3～5片，用小刀切去多余组织，只保留mPFC区域，整个过程在8 min内完成，高渗糖溶液温度维持在4℃。24孔培养板孔内加0.5 mL的脑片培养液，即低糖DMEM培养基，其中包括1%青链霉素混合液，将取好的脑片移入Transwell的小室中，尽量完全吸弃高渗糖溶液，将小室放入培养板中，使培养基的液面刚好达到脑片的水平，但不漫过脑片，将培养皿置于37℃培养箱中的自制密闭容器中，自制密闭容器有输入和输出气体的导管。脑片培养基的组成：低糖DMEM+1%的青链霉素混合液。脑片的培养条件为：温度37℃，持续稳定通入95%O2+5%CO2混合气体，微生物培养箱中培养。要保证脑片的上表面充分暴露于气体环境中。

1.3.2 充N2法制备脑片缺氧缺糖模型 将缺氧缺糖组的脑片更换为EBSS培养基，并移进充入5%CO2+95%N2混合气体的密闭容器中，在37℃培养箱中是以0.5 L/min的流量充入混合气，于15 min后换成低糖培养基并复氧，通入95%O2+5%CO2混合气体，在37℃培养箱中复灌培养 1 h。

1.3.3 分组 正常组：选取正常昆明小鼠6只，取mPFC脑区，采用低糖DMEM培养基并通入95%O2+5%CO2混合气体进行培养。

缺糖缺氧复灌组（OGD/R）：选取正常昆明小鼠6只，取mPFC脑区，采用EBSS培养基并通入5%CO2+95%N2混合气体进行培养15 min，并进行复灌，即将带有脑片的小室置入加入DMEM培养基的培养皿中，并持续通入95%O2+5%CO2混合气体1 h。

缺糖缺氧复灌给药组（OGD/R+BDNF）：选取正常昆明小鼠6只，取mPFC脑区，采用在EBSS培养基中加入BDNF（BDNF 用量为 50 ng/μL）并通入 5%CO2+95%N2混合气体进行培养15 min，并进行复灌，即将带有脑片的小室置入加入DMEM培养基的培养皿中，并持续通入95%O2+5%CO2混合气体1 h。

1.3.4 对检测样品的制备和免疫印迹分析 在模型制作完成后，将脑片移入洁净的EP管中，加入蛋白裂解液，用电动匀浆器将组织打碎，充分裂解组织，4℃10 000转离心30 min，弃去沉淀，将上清液移入新EP管中，并做好标记。用BCA试剂盒进行蛋白定量，测定蛋白浓度，将样品配平，按照每孔20 ng的蛋白量进行上样跑电泳，采用半干转的方式将胶中的蛋白转到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭 1 h，移入 GFAP（1∶1 000）一抗和 GAPDH（1∶5 000）一抗中4℃过夜，室温复温30 min,washing buffer清洗3次，5 min/次，转入HPR标记的兔二抗中孵育40 min，washing buffer清洗3次，15 min/次。用化学发光仪进行曝光记录。用ImageJ软件进行定量分析。

1.4 统计方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，采用单因素方差分析，（one-way ANOVE）进行组间比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

正常组GFAP蛋白的相对表达量为 （1.066 33±0.356 753），缺糖缺氧复灌组GFAP蛋白的相对表达量为（2.317 57±0.578 685），缺糖缺氧复灌给药组GFAP蛋白的相对表达量为（1.377 63±0.0619 96）。通过对正常组、缺糖缺氧复灌组和缺糖缺氧复灌给药组的小鼠mPFC脑区的GFAP蛋白的表达进行比较，通过蛋白免疫印迹的检测结果显示，缺糖缺氧复灌组与正常组相比GFAP蛋白的相对表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），缺糖缺氧复灌给药组与缺糖缺氧复灌组相比GFAP的蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。缺糖缺氧复灌给药组与正常组相比GFAP的蛋白相对表达量差异无统计学意义 （P＞0.05）。 见图 2。

图2 GFAP表达水平比较

3 讨论

脑部缺糖缺氧是脑缺血病患的主要症状，它可以导致人类残疾或者死亡，众多的研究表明脑组织的缺糖缺氧会诱发一系列的病理变化，甚至短暂性的缺糖缺氧也会对脑组织造成一定的损伤[8]。脑组织主要由神经元和神经胶质细胞组成，神经胶质细胞的数量是神经元的10～50倍，其中大部分为星形胶质细胞[1-2]。有报道称BDNF具有神经保护和神经营养的作用，可以帮助神经损伤后传导功能的恢复。缺糖缺氧对脑组织的损伤尤其表现在星形胶质细胞的大量增生上。mPFC脑区与运动、学习记忆等功能关系密切，此脑区的损伤会影响多个生理功能[7]。在缺糖缺氧的条件下加入BDNF，能有效减缓GFAP蛋白表达量的升高。正常组GFAP蛋白的相对表达量为（1.066 33±0.356 753），缺糖缺氧复灌组GFAP蛋白的相对表达量为（2.317 57±0.578 685），缺糖缺氧复灌给药组GFAP蛋白的相对表达量为（1.377 63±0.0619 96）。缺糖缺氧复灌组与正常组相比GFAP蛋白的相对表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），缺糖缺氧复灌给药组与缺糖缺氧复灌组相比GFAP的蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。缺糖缺氧复灌给药组与正常组相比GFAP的蛋白相对表达量升高，差异无统计学意义（P＞0.05）。采用建立mPFC脑区脑片缺糖缺氧的模型，很好的模仿了短暂性脑缺血的症状，同时加入BDNF的实验，验证了BDNF在短暂性缺糖缺氧对mPFC脑区GFAP蛋白的作用，以此说明BDNF可以有效降低GFAP蛋白的表达量，抑制星形胶质细胞的活化，减少炎性因子的释放，从而减少神经元的损伤[11]。

现有报道显示BDNF作为一种重要的脑源性神经生长因子对于脑内神经元都起到很好的保护和营养作用，其中也包括mPFC脑区，在慢性病理性疼痛下大鼠的mPFC内的BDNF表达量升高[12]。而对GFAP蛋白在mPFC的研究仅限于抑郁症等精神类疾病的研究上，文献报道中提到的脑卒中后抑郁症条件下BDNF和GFAP均有影响[13-14]。对于由于脑缺血所造成的缺糖缺氧症状而引起的星形胶质细胞增多，从而造成神经元的损伤方面却没有研究，该研究正好填补了这一空白。

综上所述，BDNF在小鼠mPFC脑区缺糖缺氧条件下，GFAP蛋白的表达量比未使用BDNF的蛋白表达量降低，说明BDNF可以有效降低星形胶质细胞GFAP蛋白的表达，从而说明可以抑制星形胶质细胞的增多，从而降低炎性因子对神经元的损伤，从而起到保护神经元的作用，以上实验给BDNF的临床应用提供了实验依据，若对BDNF的作用机制和作用效果进行更进一步的研究，将会改善由于脑缺血造成的神经系统疾病的治疗方法。此研究的应用前景非常广阔。