骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠牙槽骨结构及骨代谢生化指标的影响*

曾 辉 唐成芳 周 芳 左艳萍 张耀超

骨质疏松是中老年人的常见病和多发病，骨质疏松症的主要特征包括骨矿密度降低、骨微结构破坏，以致骨的脆性增加，骨折危险性增高[1]。临床及动物实验研究证实,系统性骨质疏松患者同时伴有牙槽骨骨质疏松样改变[2-3]。牙槽骨是上下颌骨包围和支持牙根的骨组织，牙槽骨骨质疏松可加重牙周炎骨吸收[4]、延长种植体骨融合时间[5]，使牙齿及种植体松动、脱落、缺失率增加，妨碍老年人咀嚼、发音功能及面部协调美观，严重影响老年人的身心健康和生活质量。因此，寻找防治骨质疏松的药物，以维护老年人口腔及全身健康已成为一项重要任务。

骨碎补总黄酮是从中药骨碎补中提取的有效成分。研究表明，骨碎补总黄酮可增加骨质疏松大鼠椎骨的骨量，改善骨三维结构[6]，并已初步运用于临床骨质疏松症的辅助治疗[7]，但它对牙槽骨结构的影响及相关机制的研究尚未展开。本研究拟将骨碎补总黄酮以全身用药的方式给予去卵巢雌性大鼠，观察该药对去卵巢大鼠牙槽骨结构的影响，同时观察大鼠血钙、血磷、碱性磷酸酶水平以提供骨代谢信息，为骨碎补总黄酮防治牙槽骨骨质疏松的临床应用提供实验依据。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组 24只3月龄雌性未孕SD大鼠(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，体重230±30g。自由饮水，分笼饲养。适应性饲养1周后，按随机数字表法分为3组：对照组、模型组、骨碎补总黄酮组，每组8只。

1.1.2 实验药物与试剂 骨碎补总黄酮(中国中医研究院西苑医院和四川中药研究所研制，批号961214)，使用时加灭菌水制成一定浓度溶液(0.46g·L-1)。水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠牙槽骨骨质疏松模型造模与给药对照组仅切除双侧卵巢附近脂肪组织，其余两组行双侧卵巢切除术，术后1周对建模大鼠进行阴道涂片，连续5d，观察去卵巢大鼠不出现动情周期，表明去除卵巢成功。从去卵巢手术当天开始计时，术后3个月骨碎补总黄酮组给予骨碎补总黄酮216mg/(kg·d-1)灌胃治疗，对照组和模型组给予等计量的生理盐水，连续服药12周。

1.2.2 血钙(Ca)、血磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)浓度检测 各组大鼠连续灌胃12周，腹腔注射麻醉后腹主动脉取血，3500r·min-1离心15min，取血清，采用日立7170型全自动生化分析仪检测大鼠血清Ca、P、ALP浓度，血Ca、血P、ALP试剂盒(北京华英生物技术研究所，HY2468)。

1.2.3 牙槽骨病理形态观察 连续灌胃给药12周处死动物，取其左侧下颌牙槽骨磨牙段，立即放入10%甲醛内固定48h后取出，10%EDTA脱钙3周，常规石蜡包埋，沿下颌正中矢状断面切成5μm厚的连续切片，牙合染色，光镜观察。

1.2.4 牙槽骨骨组织形态计量学测量 上述各组大鼠下颌牙槽骨磨牙段常规制片，利用MOTIC微机图像处理系统进行骨组织形态学测量。在光镜下采集下颌第二磨牙两个牙根之间松质骨图像，依照等距随机抽样原则，同一标本选3张切片，每张切片选3个观察视野。用Motic Med6.0数码医学图像分析系统对上面所得图像进行骨组织形态计量学相关参数测定，包括以下指标：总组织面积(T.Ar)、骨小梁周长(Tb.Pm)和骨小梁面积(Tb.Ar)。利用相关公式计算：骨小梁面积百分率%Tb.Ar=Tb.Ar/T.Ar×100%；骨小梁厚度Tb.Th=(2/1.99)×(Tb.Ar/Tb.Pm)；骨小梁间距 Tb.Sp=(T.Ar-Tb.Ar)/Tb.Pm[8]。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行分析。测量值以x±s表示，样本间的比较采用单因素组间方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.结果

2.1 牙槽骨组织病理形态观察 光镜下观察大鼠下颌第二磨牙矢状切面图(图1)可见：对照组大鼠下颌第二磨牙两牙根间的牙槽骨由骨小梁和骨髓腔组成，骨小梁致密，整齐排列，相互连接，骨髓腔间隙小，未见异常骨吸收；模型组大鼠牙槽骨吸收严重，骨小梁稀疏、断裂、排列紊乱，局部呈蚕食样改变，骨髓腔增大，出现骨质疏松样改变；经骨碎补总黄酮治疗后，可见牙槽骨骨小梁变粗呈片状，骨髓腔缩小，骨小梁间隙减小，骨量增多。

图1 各组大鼠牙槽骨病理组织学改变(HE 100×)

2.2 牙槽骨形态计量学参数测量 由表1可知，与对照组相比，模型组%Tb.Ar减少36.72%(P＜0.05)，Tb.Th 显著减小(P＜0.05)，Tb.Sp 显著增加(P＜0.05)。与模型组相比，骨碎补总黄酮组%Tb.Ar升高39.91%(P＜0.05)，Tb.Th显著增高(P＜ 0.05)，Tb.Sp 显著减小(P＜ 0.05)，其中%Tb.Ar已与对照组无统计学差异(P＞0.05)。

表1 各组大鼠牙槽骨骨小梁参数(s,n=8)

表1 各组大鼠牙槽骨骨小梁参数(s,n=8)

注：*与对照组比较P＜0.05；#与模型组比较P＜0.05。

组别 骨小梁面积百分率%Tb.Ar骨小梁厚度Tb.Th(μm)骨小梁间距Tb.Sp(μm)对照组模型组骨碎补总黄酮组51.63±11.96#32.67±3.06*45.71±9.25#156.98±42.14#107.54±25.08*139.08±50.13*#128.78±33.21#256.39±50.68*166.37±33.61*#

2.3 各组大鼠血Ca、P、ALP浓度变化 如表2所示，与对照组比较，模型组大鼠血Ca显著降低(P＜0.05)，ALP显著升高(P＜0.05)。骨碎补总黄酮治疗后，可显著升高大鼠血Ca(P＜0.05)，降低ALP水平(P＜0.05)，但对大鼠血P无明显作用。

表2 各组大鼠血钙、血磷、碱性磷酸酶浓度(x±s,n=8)

3.讨论

近年来，不少学者对全身性骨质疏松与牙槽骨骨质疏松间的关系做了若干研究，大多研究结果证实牙槽骨骨量丢失、出现骨质疏松样改变是全身骨质变化的局部表现[9]。本实验中，模型组大鼠牙槽骨骨小梁稀疏，出现大的骨髓腔，呈典型骨质疏松样改变。骨碎补总黄酮是骨碎补中所含黄酮类化合物的总和，具有补肾壮骨、续伤止痛的功效。体外实验证实，骨碎补总黄酮能促进人牙周膜细胞增殖[10]，而牙周膜中成功分离的干细胞正是牙槽骨再生的主要细胞来源；动物实验研究显示，骨碎补总黄酮能改善骨质疏松大鼠股骨微结构，增加骨密度和机械强度[11]；临床研究证实骨碎补总黄酮能有效治疗绝经后女性骨质疏松症,可有效缓解骨质疏松性骨痛症[12]。由于口腔骨丢失是全身骨质变化的局部表现，因此，应用骨碎补总黄酮对牙槽骨骨质疏松进行防治研究具有合理性。

本研究显示，骨碎补总黄酮连续治疗12周后，牙槽骨组织形态较模型组显著改善，骨髓腔减小、骨小梁变粗。骨组织形态计量学结果显示：经骨碎补总黄酮治疗后牙槽骨骨小梁厚度、骨小梁面积百分率较模型组显著增加(P＜0.05)，骨小梁间距显著减小(P＜0.05)，其中骨小梁面积百分率与对照组相比已无统计学差异(P＞0.05)。以上结果说明，骨碎补总黄酮对卵巢切除所致的牙槽骨结构的破坏有明显改善作用,对牙槽骨骨质疏松症有明显的防治作用。

血清钙磷浓度变化在骨矿代谢中占有重要位置，其中血清中钙含量的检测对钙磷代谢的研究具有重要意义[13]。本研究中，骨碎补总黄酮可显著增加去卵巢大鼠血钙浓度(P＜0.05)，提示其可抑制血清中钙含量的丢失，从而影响骨矿代谢。各组之间血磷浓度差异无统计学意义(P＞0.05)，这与杨锋等[14]研究结果一致，而血磷水平稳定正是骨生长和矿化的必要条件之一[15]。血ALP是反应骨代谢最重要的酶，是最常见的评价骨形成和骨转换的指标[16]。本实验中，模型组大鼠血清ALP升高可能是骨质流失、骨吸收亢进伴成骨细胞功能活跃的结果，反映了骨改建的活跃状态，骨碎补总黄酮连续治疗12周后可显著降低大鼠血ALP水平，说明骨碎补总黄酮能纠正去卵巢所致大鼠血ALP水平升高的高骨转换率现象。本实验中骨碎补总黄酮治疗组仍有一些检测指标未恢复至正常水平，可在后期进一步研究其最佳给药剂量及治疗时间。

综上所述，去卵巢可诱导大鼠牙槽骨骨量丢失，出现骨质疏松样改变，血清骨代谢指标表现为骨高转换。骨碎补总黄酮可以明显改善牙槽骨结构、增加牙槽骨骨量，血清骨代谢指标提示其可能通过降低骨高转换，抑制牙槽骨吸收，促进牙槽骨形成。但其具体影响机制、最佳剂量及给药时间等还需要进一步研究和探讨。