PCBP2促进口蹄疫病毒增殖的机制研究

何艳春，杨文萍，付绍祖，郑海学*，杨孝朴*

(1. 甘肃农业大学 动物医学院，兰州 730070；2. 中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原微生物学 口蹄疫流行病学国家重点实验室，兰州 730046)

口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)是一种单股正链RNA病毒，能引起牛、猪等多种偶蹄动物发生口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)[1]。临床主要表现为患病动物的口、唇和蹄等部位出现水泡或烂斑。发病率达100%，死亡率低(可引起幼畜较高的死亡率)，但可造成动物生产能力下降，肉质受损，且严重影响种用价值。FMDV基因组包含5′非编码区(UTR)、一个完整的开放阅读框(ORF)和一个带有Poly(A)尾巴的3′UTR。ORF编码一个多聚蛋白，随后被切割成至少13个蛋白，例如VP1、VP2、VP3、VP4、先导蛋白酶(Lpro)、2A、2B、3A、3B1、3B2、3B3、3Cpro和3Dpro[2-3]。病毒衣壳是由VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白各60个分子构成，其中VP1、VP2和VP3作为病毒衣壳的亚单位，主要构成病毒衣壳的外表面。VP4与RNA紧密连接，与FMDV衣壳的内部结构有关，VP0是VP2和VP4的前体蛋白，其结构中，VP4位于VP2氨基末端的延伸部位。前期研究表明FMDV蛋白可以调控干扰素的产生，例如，Lpro能抑制poly(I:C)诱导IFN-λ1的启动子活性；3Cpro通过影响IRF-3/7的活性来拮抗IFN-α1/β的启动子激活[4]。VP1与宿主蛋白可溶性耐药相关钙结合蛋白(soluble resistance-related calcium-binding protein, Sorcin)发生互作抑制Ⅰ型干扰素的产生[5]。VP3通过降解VISA抑制IFN-β的活性[4]。那么是否有宿主蛋白与FMDV蛋白互作通过天然免疫途径调控FMDV增殖？本研究发现宿主蛋白PCBP2能与FMDV VP0互作，并通过天然免疫途经调节FMDV增殖。

天然免疫在保护宿主不被病原体入侵中起到关键性作用。Ⅰ型干扰素中IFN-α和IFN-β是先天抗病毒应答的核心成员。主要有两类模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原相关分子模式(pathogens-associated molecular patterns, PAMPs)，分别为Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)和RIG-Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ like receptors, RLRs)[6-8]。RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated protein, MDA5)作为胞质传感器，能检测到细胞质中RNA病毒(例如仙台病毒SeV和新城疫病毒NDV等)[9]。在RLRs介导的抗病毒应答过程中，入侵细胞内的病毒分子主要被RIG-Ⅰ和MDA5识别，并招募下游位于线粒体的接头蛋白VISA(也称作IPS-1、CARDIF和MAVS)[10]来激活下游通路[11]。随后，VISA通过激活蛋白激酶TBK1磷酸化修饰转录因子IRF3，使其形成二聚体，进入细胞核中[12-13]。活化的转录因子IRF3入核后结合到IFNB1基因启动子的干扰素刺激反应元件ISRE位点，诱导IFNs和多种ISGs因子的产生，并在其他效应因子的协同下发挥抗病毒功能。

多聚胞嘧啶结合蛋白2[poly(rC) binding protein 2, PCBP2]是一种在人类和小鼠中广泛表达的宿主蛋白，不仅参与RNA的复制和翻译[14]，也参与到蛋白之间的相互作用[15-17]。有研究报道PCBP2能与VISA特异性结合，进而抑制细胞中RIG-Ⅰ通路的抗病毒感染应答；过表达PCBP2可特异性引起VISA蛋白的降解从而抑制IFN-β的产生[18]。尽管PCBP2通过特异性降解VISA来抑制RIG-Ⅰ通路的抗病毒免疫反应，抑制细胞中IFN-β启动子活性，进而增强病毒在细胞中的活性[18]，但是PCBP2与FMDV蛋白通过天然免疫来调控FMDV增殖的机制还不清楚。作者利用免疫共沉淀试验、GST pull-down试验、双荧光素酶报告系统试验和Western blot试验对此进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

pcDNA3.1/myc-HisA载体由本实验室保存。pcDNA3.1-myc-PCBP2质粒、HA-PCBP2质粒和带Flag标签的且被克隆在PCAGGS载体上的各口蹄疫蛋白质粒，均由本实验室构建保存，且测序鉴定为正确。双荧光素酶报告系统所需质粒，仙台病毒(Sendai virus, SeV)以及带HA标签的VISA质粒由武汉大学舒红兵院士馈赠。鼠抗Flag、HA、Myc单克隆抗体购于Sigma公司。兔抗VISA多克隆抗体购自BETHYL公司。兔抗GST多克隆抗体和鼠抗β-actin单克隆抗体购自Thermo公司。HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗和抗兔IgG二抗均购自Santa Cruz公司。人源胚胎肾细胞系HEK293T用含10%灭活胎牛血清(FBS, Gibco)的DMEM培养基(Gibco)在37 ℃、5%CO2温箱中培养。

1.2 免疫共沉淀和蛋白印迹

HEK293T细胞培养在10 cm培养皿中，待生长为90%左右的单层细胞时，将FMDV VP0、VP2、L、2B、2C、3A、3C和3D分别与PCBP2质粒共同转染HEK293T细胞。24 h后弃掉培养基，加入NP-40裂解液[50 mmol·L-1Tris (pH 8.0), 150 mmol·L-1NaCl, 5 mmol·L-1EDTA, 1%NP-40, 2 mg·mL-1aprotinin, 2 mg·mL-1leupeptin, 1 mmol·L-1phenylmethanesulfonyl fluoride]，冰上孵育30 min并收集液体，12 000 r·min-1离心10 min。取适量上清加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸10 min后离心，进行Western blot试验；将剩余上清平分，加入IgG抗体和Flag或HA抗体，再加入G蛋白琼脂糖珠(Sigma)，用裂解液补至1 mL，4 ℃旋转摇床孵育3 h。用裂解液清洗树脂3次，SDS-PAGE裂解煮沸，进行Western blot。

Western blot试验方法，将质粒转入培养好的细胞，24 h后收样并处理，煮沸10 min后12 000 r·min-1离心10 min。将处理好的样品加入蛋白胶孔，跑至底部，用浸泡过甲醇的PVDF膜转膜。将转好的膜用5%的脱脂奶粉封闭30 min，之后加入一抗4 ℃摇床过夜，回收抗体，洗三次，加入二抗，洗三次，随后曝光。

1.3 双荧光素酶报告试验

将HEK293T细胞培养于24孔板，待细胞生长至70%左右，将IFN-β-Luc/ISRE-Luc报告质粒、PRL-TK内参质粒以及PCBP2三种质粒共同转入细胞，用空载体确保每一个孔接收相同的质粒。24 h 后用SeV(100 HAU·mL-1)进行接毒试验，12 h后处理细胞，用双荧光素酶报告基因试剂盒(Promega)照其说明书进行试验。

1.4 GST pull-down试验

首先取80 μL GST树脂于EP管中，10% BSA封闭，于4 ℃旋转摇床孵育4～6 h。然后加入TIF buffer(1.0 mmol·L-1MgCl2, 20 mmol·L-1Tris (pH 8.0), 0.1% Nonidet P-40, 150 mmol·L-1NaCl, 10% glycerol, 0.1 mmol·L-1DTT)清洗树脂六次。在封闭好的树脂中分别加入纯化的GST和GST融合蛋白，用TIF buffer补液，于4 ℃旋转摇床孵育2.5 h后清洗树脂，然后在树脂中加入表达有目的质粒的HEK293T细胞裂解液，于4 ℃ 旋转摇床孵育4～6 h，清洗树脂，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸处理，进行Western blot试验。

1.5 数据分析

使用单因素方差分析法进行统计学分析(数据为三次独立试验的平均值)。差异显著性用“*”表示(*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001)

2 结 果

2.1 鉴定与PCBP2发生互作的FMDV蛋白

为了验证PCBP2与哪些口蹄疫病毒蛋白有相互作用，将FMDV VP0、VP2、L、2B、2C、3A、3C和3D分别与PCBP2表达质粒共同转染，免疫共沉淀试验显示PCBP2与FMDV的VP2、2B、L、VP0、2C和3D有相互作用(图1a、b)。进一步用GST pull-down试验证实PCBP2与FMDV的VP0、VP2、2B、2C和3D有相互作用(图1c、d)。

2.2 PCBP2负调控VISA介导的细胞信号通路

为了探究猪源PCBP2是否对Ⅰ型干扰素通路有影响，首先将HEK293T细胞铺于24孔细胞板，每组样品设置4个重复，16 h后将重组质粒Myc-PCBP2、100 ng IFN-β-Luc/ISRE-Luc报告质粒、20 ng PRL-TK内参质粒三种质粒共同转染HEK293T细胞，用相应空载体确保每一个孔细胞接收相同质粒，24 h后用SeV刺激4个重复中的2个重复，剩下2个重复不做接毒处理，12 h后收集样品进行双荧光素酶报告系统检测。结果表明，猪源PCBP2抑制IFN-β和ISRE的活性(图2a、b)。

进一步将不同剂量Myc-PCBP2(0、0.3、0.6、1.2 μg)与100 ngIFN-β-Luc/ISRE-Luc报告质粒、20 ng PRL-TK内参质粒以及HA-VISA(0、2.5 ng)质粒共同转染HEK293T细胞，24 h后进行双荧光素酶报告系统检测。结果表明，猪源PCBP2抑制VISA诱导的IFN-β和ISRE的活性(图2c、d)。

2.3 FMDV蛋白2C、3D、VP0、2B增加了猪源PCBP2对IFN-β启动子活性的抑制作用

为了探索哪些FMDV蛋白影响PCBP2负调控VISA介导的细胞信号通路。将FMDV蛋白L、VP2、2C、3D、VP0、2B(均100 ng)分别与Myc-PCBP2(500 ng)、100 ng IFN-β-Luc报告质粒、20 ng PRL-TK内参质粒以及2.5 ng HA-VISA质粒共同转染HEK293T细胞，双荧光素酶报告系统试验证明，2C、3D、VP0、2B蛋白促进PCBP2对IFN-β的抑制作用(图3)。

a、b. 将带Flag标签的FMDV蛋白VP2、2B、3A、L、VP0、2C、3C和3D(10 μg)分别与HA-PCBP2(10 μg)共同转入HEK293T细胞(2×106)，用HA/IgG(a)和Flag/IgG(b)抗体进行免疫共沉淀，随后用Flag/HA进行蛋白印迹试验；c、d.将带有Flag标签的口蹄疫病毒蛋白L、VP0、VP2、2B、2C、3D(10 μg)进行转染，24 h后进行GST pull-down试验，图上从左到右依次为2B分别与GST、GST-PCBP2，2C分别与GST、GST-PCBP2，3D分别与GST、GST-PCBP2，L分别与GST、GST-PCBP2，VP0分别与GST、GST-PCBP2以及VP2分别与GST、GST-PCBP2的GST pull-down试验，随后用Flag(上)、GST(中)进行蛋白印迹试验，WCL(底部)是用蛋白印迹试验验证蛋白表达a, b. HEK293T cells (2×106) were transfected with the indicated plasmids (10 μg each). Immunoprecipitation, with anti-Flag (HA) or control mouse immunoglobulin (IgG) of proteins from lysates and immunoblot were performed with anti-HA or anti-Flag; c, d. Flag-tagged FMDV proteins L, VP0, VP2, 2B, 2C, 3D transfected for 24 h with 10 μg plasmid, tested by GST pull-down. GST pull-down (from left to right): 2B/GST, 2B/GST-PCBP2, 2C/GST, 2C/GST-PCBP2, 3D/GST, 3D/GST-PCBP2, L/GST, L/GST-PCBP2, VP0/GST, VP0/GST-PCBP2, VP2/GST, VP2/GST-PCBP2 and immunoblot were performed with anti-Flag (top) or anti-GST (middle), WCL (bottom), expression of proteins图1 与PCBP2发生互作的FMDV蛋白Fig.1 The FMDV proteins interact with PCBP2

a、b.将重组质粒Myc-PCBP2(0、500 ng)、100 ng IFN-β-Luc/ISRE-Luc报告质粒、20 ng PRL-TK内参质粒共同转染HEK293T细胞，24 h后用SeV刺激12 h(右)，收集样品进行双荧光素酶报告系统检测；c、d. 将不同剂量Myc-PCBP2(0、0.3、0.6、1.2 μg)与100 ng IFN-β-Luc/ISRE-Luc报告质粒、20 ng PRL-TK内参质粒以及HA-VISA(0、2.5 ng)质粒共同转染HEK293T细胞，24 h后进行双荧光素酶报告系统检测；EV、VEC指相对应载体蛋白的空载体；每组数据均为三次或者三次以上独立试验的结果；**.P<0.01为差异极显著a, b. HEK293T cell were transfected with 100 ng reporter plasmid (IFN-β-Luc/ISRE-Luc), 20 ng pRL-TK and PCBP2 (0, 500 ng) and infected for 24 h with SeV (right), assessed as luciferase activity after 12 h; c, d. HEK293T cell were transfected with luciferase reporter constructs plus PCBP2 (0, 0.3, 0.6, 1.2 μg), assessed as luciferase activity after 24 h. EV. Empty vector; VEC. Vector empty control; The results represent the means and standard deviations of data from three independent experiments. **.P<0.01图2 猪源PCBP2抑制VISA诱导的IFN-β和ISRE的产生Fig.2 Porcine PCBP2 inhibites VISA-induced IFN-β and ISRE

a、b、c、d、e、f. 将FMDV蛋白L、VP2、2C、3D、VP0、2B(0、100、0、100 ng)分别与Myc-PCBP2(0、0、500、500 ng)、100 ng IFN-β-Luc报告质粒、20 ng PRL-TK内参质粒以及HA-VISA(0、2.5 ng)共同转染HEK293T细胞，24 h后进行双荧光素酶报告系统试验。EV指相对应载体蛋白的空载体；Con. VP0载体蛋白相对应的空载体是PCAGGS，Myc-PCBP2对应的空载体是pcDNA3.1；每组数据均为三次或者三次以上独立试验的结果；**.P<0.01为差异极显著a, b, c, d, e, f. HEK293T cell were transfected with 100 ng reporter plasmid, 20 ng pRL-TK, HA-VISA (0, 2.5 ng) various FMDV plasmids (0, 100, 0, 100 ng) and Myc-PCBP2 (0, 0, 500, 500 ng) for 24 h, assessed as luciferase activity. EV. Empty vector; Con.The corresponding empty vector of VP0 is PCAGGS, the corresponding empty vector of Myc-PCBP2 is pcDNA3.1;The results represent the means and standard deviations of data from three independent experiments. **P<0.01图3 2C、3D、VP0、2B蛋白促进PCBP2对IFN-β的抑制作用Fig.3 The effect of IFN-β inhibited by PCBP2 is promoted by 2C, 3D, VP0, 2B proteins

2.4 VP0促进PCBP2对VISA的特异性降解

为了验证哪些FMDV蛋白促进PCBP2降解VISA，将FMDV 2C、3D、VP0和2B蛋白(600 ng)分别与猪源PCBP2(1 μg)、VISA(800 ng)共转染，Western blot试验显示FMDV VP0和3D促进PCBP2特异性降解外源VISA(图4a～d)。进一步试验表明，只有VP0促进PCBP2对内源VISA的特异性降解(图4e、f)。

3 讨 论

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、接触性传染的动物疫病，是国家乃至全球经济贸易的最大羁绊。由于FMDV广泛的宿主范围，高效的变异频率[19-20]，从而有利于FMDV逃避宿主免疫监视，建立持续性感染[21]。宿主细胞作为FMDV生命活动载体，在其生活周期中，发现有多种宿主细胞蛋白参与其中。由于FMDV是一种RNA病毒，这些细胞蛋白里有一部分是RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)，例如多聚嘧啶结合蛋白(PTB)[22]、La自身抗原(La autoantigen)[23]、核糖体40S亚基(40S ribosomal subunit)[24]、突触结合胞质RNA相互作用蛋白(NSAP1)[25-26]以及核不均一核糖核蛋白(hnRNP)[27]等，而PCBP2细胞蛋白是属于特异性结合RNA胞嘧啶富集片段的HnRNP[28-30]。已有研究报道PCBP2能够调控细胞的免疫应答反应[18]，促进FMDV的增殖[31]，那么阐明PCBP2在FMDV引起免疫抑制中的分子机制，则有利于对FMD进行有效的防控提供科学依据。本文首先验证出与PCBP2发生互作的FMDV蛋白(VP2、2B、VP0、2C、3D)。接着阐明PCBP2负调控细胞的免疫应答。将互作蛋白分别与PCBP2共转染，双荧光素酶报告试验初步证实2C、3D、VP0和2B进一步抑制IFN-β的产生。据文献报告，PCBP2能够通过E3泛素连接酶AIP4泛素化降解VISA，以达到对细胞免疫应答的负调控作用[32]，随后将2C、3D、VP0和2B分别与PCBP2共转染，Western blot试验检测内、外源VISA的降解情况。结果表明，VP0和PCBP2共转染能增加VISA的降解，从而减少免疫应答中IFN-β的产生，增强FMDV在宿主细胞中的活性。前言中提到VP3也能降解VISA，抑制IFN-β的产生，但VP3是通过影响VISA的RNA水平达到降解VISA蛋白的目的，抑制细胞的免疫应答；而VP0对VISA转录水平的影响将在后续试验中进行，目前推测VP0可能通过泛素化途径直接或间接降解VISA，以达到对IFN-β启动子活性的抑制，促进FMDV的增殖，这些猜想还需要进一步验证。对于VP0、PCBP2和VISA三者之间的具体关系，也需要我们继续深入研究下去。

a、b、c、d. 将FMDV 2C、3D、VP0和2B蛋白(600 ng)分别与猪源Myc-PCBP2(1 μg)、HA-VISA(800 ng)转入HEK293T细胞，24 h后进行Western blot试验；e、f. 将FMDV VP0和3D蛋白(600 ng)分别与猪源Myc-PCBP2(1 μg)转入HEK293T细胞，24 h后进行Western blot试验a, b, c, d. Immunoblot analysis of HEK293T cells transfected with plasmids encoding HA-tagged VISA (800 ng)， Myc-tagged PCBP2 (1 μg) and various FMDV plasmids (600 ng) for 24 h; e, f. Immunoblot analysis of HEK293T cells transfected with plasmids encoding Myc-tagged PCBP2 (1 μg) and various FMDV plasmids (600 ng) for 24 h图4 VP0加速PCBP2对VISA的特异性降解Fig.4 VP0 accelerate the specific degradation of VISA from PCBP2

4 结 论

PCBP2能够与FMDV蛋白VP0、VP2、2B、2C和3D发生相互作用，且负调控Ⅰ型干扰素产生的信号通路，同时PCBP2能特异性降解VISA并呈剂量依赖效应；双荧光素酶报告试验证实VP0、2B、2C和3D蛋白可以促进PCBP2对IFN-β启动子活性的抑制作用，其中只有VP0蛋白能协助PCBP2进一步引起VISA的特异性降解。由此可知，PCBP2通过与FMDV VP0蛋白相互作用，引起通路蛋白VISA的进一步降解，导致宿主细胞中IFN-β分泌减少，从而保护FMDV在细胞中的繁殖和生长。