番茄褪绿病毒在湖南省首次发生

王雪忠张战泓郑立敏唐 鑫史晓斌刘 勇*

（1湖南大学研究生院隆平分院，湖南长沙 410125；2湖南省植物保护研究所，湖南长沙 410125；3湖南省蔬菜研究所，湖南长沙 410125）

番 茄 褪 绿 病 毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）属于长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（Crinivirus），于1998年在美国佛罗里达州首次发现（Wisler et al.，1998）。截至目前，ToCV已在我国台湾、北京、山东、天津、河北和河南等地发生流行，对各地番茄生产造成了严重影响（Tsai et al.，2004；Zhao et al.，2013；刘永光 等，2014；周涛 等，2014；胡京昂 等，2015；孙国珍 等，2015）。ToCV侵染的典型症状是植株下部叶片先观察到叶脉间黄化褪绿。发病初期叶片除叶脉仍保持绿色外，脉间变黄，叶片变厚；发病中期，整个叶片由边缘向内开始出现坏死斑；发病后期，整个植株死亡，果实受到严重影响（赵黎明，2015）。早期感染ToCV的番茄产量损失可达到75%，甚至绝产；中后期感染ToCV仍会对番茄造成10%～40%的产量损失（刘永光 等，2014）。该病毒的寄主主要有茄科（Solanaceae）和夹竹桃科（Apocynaceae）等 6个 科 植 物（Wintermantel & Wisler，2006；Landeo-Ríos et al.，2015），其中对番茄造成的产量损失最为显著。ToCV只能通过韧皮部侵染的方式侵染植物，由媒介昆虫以半持久的方式传播，其媒介昆虫包括烟粉虱（Bemisia tabaci）、温室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）、银叶粉虱（B.argentifolii）和纹翅粉虱（T. abutilonea），其中以烟粉虱的传播能力最为高效（Wintermantel & Wisler，2006）。目前国内外暂未获得ToCV的抗性番茄品种（Orfanidou et al.，2016），又因媒介昆虫反复发生，杂草清理具有难度，导致ToCV防治存在困难。

2016年7月对湖南省蔬菜研究所基地进行病害调查发现，番茄、茄子、辣椒和马铃薯的叶片出现褪绿黄化、叶脉仍然保持绿色等疑似ToCV感染的症状，同时在病叶上发现了大量的烟粉虱。故分别采集症状明显的番茄、茄子、辣椒和马铃薯叶片样品，利用ToCV特异性引物进行分子鉴定，并检测发病植株上烟粉虱携带ToCV的带毒率以及烟粉虱的生物类型。

1 材料与方法

1.1 样本采集

在湖南省蔬菜研究所基地采集疑似感染ToCV的番茄、茄子、辣椒和马铃薯植株叶片各20份，以健康番茄、茄子、辣椒和马铃薯叶片作为阴性对照；以实验室ToCV侵染性克隆接种的感病叶片作为阳性对照。采集基地内发病番茄、茄子、辣椒和马铃薯植株上的烟粉虱，每种植株采集约100头烟粉虱成虫。将样品置于液氮中速冻，-80 ℃保存备用。

1.2 试验试剂

TRIzol、氯仿、无水乙醇、ddH2O、RNase-free H2O、限制性核酸内切酶（Ase I 酶）、树脂溶液（10 mg·mL-1）。

1.3 植物总RNA的提取

样品总RNA的提取采用北京华越洋生物公司多酚多糖植物RNA提取试剂盒，步骤依照试剂盒说明书操作。

1.4 烟粉虱总RNA的提取

烟粉虱RNA的提取采用TRIzol 法并稍作修改。研磨棒充分研磨虫体后加入1 mL TRIzol振荡15 s，室温放置4 min；加入200 μL氯仿，漩涡振荡30 s，室温放置3 min；4 ℃下12 000 r·min-1离心 15 min；移取上清液 500 μL 至新的RNase free离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20 ℃放置30 min；4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min；弃上清液，用现配的75%乙醇洗涤沉淀，8 000 r·min-1离心3 min；重复洗涤1次；弃上清液，8 000 r·min-1离心30 s，小心吸出上清液；室温晾干3 min，取30 μL RNase-free H2O溶 解， 测 定OD260/OD280值， 检测RNA的含量和纯度，-80 ℃保存备用。试验重复3次。

1.5 cDNA的合成

以提取的总RNA为模板，反转录反应的体系步骤参照Vazyme生物公司Hiscript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit产品说明书进行：在RNase free离心管中分别加入1 μL RNase-free H2O，4 μL Radom hexamers，3 μL 总 RNA；65 ℃加热 5 min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2 min；向上一步混合液中加入10 μL 2×RT Mix，2 μL HiscriptⅡ Enzyme Mix；混匀后按照25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min合成cDNA，-20 ℃保存备用。

1.6 RT-PCR和电泳检测

ToCV的检测采用ToCV特异性引物ToCV-3（表1）进行PCR扩增。PCR扩增体系为：ddH2O 7 μL，2×Taq Master Mix（Dye Plus）10 μL，ToCV-3R 1 μL（10 μmol·L-1），ToCV-3F 1 μL（10 μmol·L-1），cDNA模板1 μL。PCR程序为：95℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，产物纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。

表1 引物信息

1.7 烟粉虱带毒率的检测

从每种植株上采集的烟粉虱中随机选取8头，采用ToCV特异性引物ToCV-3（表1）进行ToCV检测，每种植株3次重复，统计烟粉虱的带毒率。

烟粉虱带毒率 = 携带ToCV的烟粉虱数目/ 检测烟粉虱数目×100%

1.8 烟粉虱生物类型的鉴定

烟粉虱总DNA的提取：取3 μL蛋白酶K于封口膜上，将每只烟粉虱置于其中研磨成匀浆后移至PCR管中，加入20 μL 10 mg·mL-1的树脂溶液混匀，然后置于37 ℃孵育1 h，96 ℃ 10 min。

PCR扩增体系为20 μL：2×Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物 WT（表 1）各 1 μL（10 μmol·L-1），模板 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 程序：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 15 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，PCR产物取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

酶切体系：加入Ase I 0.5 μL，3.1×buffer 2 μL，ddH2O 7.5 μL，与10 μL扩增产物混匀后置于37 ℃ 3～4 h，酶切后取5 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

从每种植株上采集的烟粉虱中随机选取20头进行检测，试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 茄科蔬菜田间感染ToCV的症状

与健康植株相比，田间番茄、茄子、辣椒、马铃薯病株的叶片表现出底部叶片黄化，叶脉浓绿而脉间褪绿黄化，叶片变脆且易折。感病严重的植株整株褪绿黄化、果实不能正常膨大，颜色偏白；叶片脉间褪绿黄化，变厚、变脆且易折（图 1）。

2.2 茄科蔬菜ToCV的发生率

对4种茄科蔬菜上疑似感染ToCV的样品进行RT-PCR检测，扩增出条带大小为449 bp的特异性条带，与目标条带一致（图2）。对目标条带纯化回收测序后在NCBI上进行比对，结果显示与北京番茄ToCV分离物（KC887999.1）部分序列相似度达到99.0%，表明所扩增到的基因片段属于ToCV的基因序列，确认此次采集的样品被ToCV感染。检出率结果显示，番茄样品的ToCV感染率为100%，茄子、辣椒和马铃薯样品的感染率分别为80%、85% 和70%（图2）。

2.3 烟粉虱体内ToCV的带毒率检测

收集病叶上的烟粉虱，并进行ToCV的RTPCR检测，PCR扩增得到条带大小为446 bp的特异性条带，与目标片段大小一致（图3）。从采集的烟粉虱中，每种植株随机选取8头进行ToCV带毒率检测（表2），番茄上烟粉虱ToCV的平均感染率最高，为87.5%，其次为茄子和马铃薯，辣椒上烟粉虱ToCV的平均感染率最低。

图1 4种茄科作物感染ToCV的症状

图2 4种茄科蔬菜ToCV PCR检测结果

2.4 烟粉虱生物类型鉴定

图3 烟粉虱体内ToCV PCR检测结果

表2 4种茄科蔬菜上烟粉虱带毒率统计

图4 烟粉虱生物类型鉴定结果

对4种茄科蔬菜上采集的烟粉虱进行生物种群鉴定，提取单头烟粉虱总DNA并进行PCR扩增，产物经Ase I消化酶切电泳（图4），结果显示该基地烟粉虱均为MED烟粉虱（Q烟粉虱）。

3 结论与讨论

本试验采集了湖南省蔬菜研究所基地4种茄科蔬菜植株叶片，利用RT-PCR方法检测疑似发病植株叶片感染ToCV的情况，经序列分析比对，确认了ToCV已经侵染湖南省的茄科作物，证实该病毒已经在湖南省发生。近年来，ToCV对我国以番茄为主的蔬菜产量和品质造成了重大损失，目前针对ToCV的研究工作主要在其分布、田间诊断和优化检测技术、致病机理、病虫互作等方面展开。

2004年Tsai等（2004）在我国台湾首次发现ToCV，随后Zhao等（2013）报道了ToCV在北京的发生，刘永光等（2014）发现ToCV在山东暴发，目前ToCV已在天津（高利利 等，2015）、河北（孙国珍 等，2015）、河南（胡京昂 等，2015）、山西、陕西、浙江、内蒙古（郑慧新 等，2016）、吉林、辽宁（王翠琳 等，2017）、广东（汤亚飞 等，2017）、海南（Tang et al.，2017）、云南（刘微 等，2018）等地相继被发现。近年来国际贸易的频繁交流，工厂化苗木调运可能使感染ToCV的植株进入我国，加之烟粉虱在我国扩散流行，这些原因使得ToCV在我国自沿海向内陆迅速蔓延。湖南省周边省市中目前只有广东省已经报道了ToCV的发生，由于湖南省蔬菜种植种类众多，苗木调运繁杂，这些原因都使得调查ToCV病毒最初来源的工作巨大且复杂，因此需要进一步分离纯化和鉴定分离物的病毒株系，对比确认其株系来源，从而精准地对ToCV进行防控，同时应通过加强对烟粉虱的检疫检验，减少人为因素造成烟粉虱的传播。

在我国ToCV主要依靠烟粉虱进行传播。2003年首次在云南省一品红（Euphorbia pulcherrima）上发现MED烟粉虱以来（Chu et al.，2006），MED烟粉虱现已遍布全国。目前的研究显示，与其他烟粉虱相比，MED烟粉虱具有分布广泛、扩散能力强、繁殖率高、抗药性强且广的特点。同时，在我国的大多数农业系统中，MED烟粉虱已经快速取代 MEAM1烟 粉 虱（Chu et al.，2010；Xi，2010；Xin et al.，2016）。已有研究表明，MED烟粉虱比MEAM1烟粉虱传播ToCV的能力更强（Shi et al.，2017）。因此，应正确识别烟粉虱的生物类型，从而采取正确措施对烟粉虱进行防治，以达到治虫防病的目的。本试验中烟粉虱ToCV的带毒率较高，但由于本试验采集的样本数量较少，后期应扩大烟粉虱采集数量，加强对烟粉虱携带ToCV的监测。

目前ToCV的防治仍以预防为主，可以通过选用无病虫害的幼苗、培育ToCV抗性新品种、田间设置防虫网、悬挂粘虫板、合理换茬，达到早预防、早控制的效果。目前ToCV的发生和流行情况日趋严重，本试验首次报道ToCV在湖南省的发生，表明ToCV有从沿海向内陆扩散的趋势，因此必须提高警惕防止ToCV的进一步蔓延，同时要加强对烟粉虱-ToCV-植物互作的研究，为ToCV的防治和治理奠定理论基础。