醋炙元胡中延胡索乙素不同提取方法比较

张艳华，包淑云，年四辉，喻丽珍，刘人豪

（皖南医学院 药学院，安徽 芜湖 241002）

元胡为罂粟科紫堇属植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的块茎，具有行气止痛、活血散瘀、治疗跌打损伤的功效.用于跌打肿痛、崩中、癥瘕、产后血晕、经闭痛经、恶露不尽等.其在李时珍的《本草纲目》等本草书籍中都有记载，是常用中药，内含约30种生物碱，主要是原小檗碱类和阿朴啡类生物碱，包括了延胡索甲素、延胡索乙素、小檗碱、黄连碱、元胡宁等，其中最主要的有效成分是延胡索乙素，2015年版《中华人民共和国药典》对其质量控制要求元胡中延胡索乙素含量不得低于0.04%[1]，因延胡索乙素是叔胺碱，易溶于有机溶剂，不易溶于水，在对其进行提取时，一般可利用其脂溶性的特性，直接用有机溶剂提取，也可以使其由叔胺碱转变成易溶于水的季胺碱后用亲水性溶剂提取，而临床上根据病症不同，主要有延胡索生用和用醋炮制后使用两种方法，用得最多的是醋制品.为了使延胡索中的有效成分被充分利用，提高延胡索乙素的提取率，本实验采用多种提取方法，以延胡索乙素为指标，采用RP-HPLC法测定不同提取方法中延胡索乙素的含量，比较不同提取方法的提取率，为延胡索被更好的利用提供参考.

1 材料与仪器

1.1 材料

元胡药材（产地为安徽宣城）购自亳州药材市场，经鉴定为罂粟科植物延胡索 (Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥块茎.延胡索乙素标准品（批号110726-201213）购自中国食品药品检定研究院，米醋（江苏恒顺醋业股份有限公司）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水.

1.2 仪器

日本岛津LC-20A高效液相色谱仪（SPD-M20A检测器、LC-20AT真空在线脱气机、CTO-10AS柱温箱、LC-20AT四元泵）、KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、D2F-6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、JY501型电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、PHS-3C精密PH计（上海越平科学仪器有限公司）.

2 方法

2.1 炮制品的制备[2]

取大小均匀的元胡100g，加入纯米醋20g拌匀，待醋液吸尽后，焖润，用文火加热炒干，粉碎，粉末过3号筛，备用.

2.2 样品的提取

2.2.1 连续回流提取法

取粉末2g,精密称定，用75%的无水乙醇250ml提取至完全，抽滤，滤液定容至250ml，取滤液50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，备用.同法平行提取3份.

2.2.2 常规水煮法

取粉末2g,精密称定，置烧杯中，加入蒸馏水250ml，用环保炉加热煮沸1.5h后，过滤，滤渣再加蒸馏水100ml煮沸1h后取出，过滤，如此反复至提取完全，合并滤液并定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，备用.同法平行提取3份.

1）系统程序设计有待优化。实现教改课题项目的信息化管理，最为关键的问题是实现教改项目数据的全面采集和挖掘，但教改项目的数据很多是以文本、关键词等为代表的非结构化数据，虽然系统设计时已经完善了项目申报书格式内容，尽可能采集具有可分析、可统计的结构化数据，但是在试用中发现，在一些程序设计上，如教师的论文发表情况这个采集点，系统没有进行限定性的选择和引导，导致收集的相关数据格式不一，无法进行有效分析。

2.2.3 温浸提取法

取粉末2g,精密称定，置锥形瓶中加入75%的无水乙醇250ml封口置80℃恒温水浴锅中温浸24h，抽滤，滤液定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，备用.同法平行提取3份.

2.2.4 微波提取法

取粉末2g,精密称定，置锥形瓶中加入75%的无水乙醇250ml,置于微波样品处理器中提取30min，温度设置60℃，功率300W，提取液抽滤，定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，备用.同法平行提取3份.

2.2.5 渗漉法

取粉末2g，精密称定，置于渗漉装置中,加75%无水乙醇250ml，渗漉30h,抽滤，滤液定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，备用.同法平行提取3份.

2.2.6 超声提取法

2.3 色谱条件

色谱柱为AgilentTC-C18(2)色谱柱（250×4.6mm，5μm），流动相为甲醇:0.3%三乙胺（冰醋酸调 pH至 6.5）（55:45），检测波长 280nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量 20μl.

2.4 对照品溶液的制备

精密称定延胡索乙素标准品0.5mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含0.05mg的对照品溶液.

2.5 供试品溶液的制备

将2.2项中制备的各提取物加甲醇溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液.

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察

精密吸取延胡索乙素对照品储备液，以甲醇配制成 10μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、50μg/ml对照品溶液，分别吸取20μl注入高效液相色谱仪，测定峰面积.以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程.

2.6.2 精密度试验

精密吸取延胡索乙素对照品溶液20μl，按上述色谱条件重复进样5次，记录峰面积，计算延胡索乙素峰面积的RSD值.

2.6.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0,2,4,8,12和24h进样分析，测定延胡索乙素的峰面积值，计算RSD值.

2.6.4 重复性实验

取元胡同一份供试品溶液，按上述色谱条件进行5次平行实验，测定延胡索乙素的含量，计算RSD值.

2.6.5 加样回收率实验

精密称取已知含量的醋炙元胡药材粉末约0.2g，6份，精密加入延胡索乙素的对照品贮备液适量，按“2.5”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下测定，计算回收率.

2.7 样品含量测定

取各提取好的样品，按“2.5”项下方法制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液20μl，按“2.3”项下色谱条件测定峰面积，计算延胡索乙素的含量，各提取方法3份取平均值.

3 结果与讨论

3.1 RP-HPLC色谱图

对照品与样品色谱图见图1.

3.2 方法学考察结果

3.2.1 线性关系考察

对照品浓度与色谱峰面积的线性回归方程为y=14391x-11523(R2=0.9992)，线性范围为 10～50μg/ml.

3.2.2 精密度试验

延胡索乙素对照品连续进样5次后，色谱峰面积的 RSD（n=5）为 1.28%.

图1 延胡索乙素标准品(A)和样品(B)的RP-HPLC图

3.2.3 稳定性试验

同一供试品溶液分别在0,2,4,8,12和24h进样分析，色谱峰面积RSD为1.41%.表明该方法有较好的稳定性.

3.2.4 重复性实验

元胡同一供试品溶液进样5次后，延胡索乙素的含量RSD为2.10%，表明样品测定重复性良好.

3.2.5 加样回收率实验

加样回收率实验延胡索乙素的平均回收率为99.03%，RSD（n=6）为 1.02%.结果见表 1.

表1 回收率试验结果

3.3 含量测定结果及讨论

各样品延胡索乙素含量测定结果见表2.从结果中看到，用水作为提取溶剂时,延胡索乙素的溶出量明显低于用75%的无水乙醇的溶出量，在同样用75%的无水乙醇提取时，连续回流提取法和超声提取法提取率都较高.这是因为延胡索乙素是原小檗碱类叔胺碱，以游离状态存在，易溶于有机溶剂，不易溶于水，而传统中药都是用水煎煮，所以临床中医使用时都是经过醋制后，使延胡索乙素上的N原子接收质子后由叔胺碱转变成季铵盐，增加水溶性，使其易于煎煮溶出，但从结果看出，虽然实验样品用的是醋制品，但是在水溶液中的提取率还是很低，并不能使延胡索乙素提取完全，所以单纯水煎煮对有效成分的利用率比较低，这也可能是因为醋炙时并没有使所有的延胡索乙素从叔胺碱变成季铵碱，所以游离的那部分并不能溶于水，而不管延胡索乙素是游离态还是成盐的状态，都是可以溶于乙醇的，所以其他的提取方法都比常规水煮法提取率高.

表2 样品中延胡索乙素含量

4 结论

本实验采用不同的提取方法对延胡索中的延胡索乙素进行了提取和含量测定，除了常规水煮法，其他方法都是使用相同的溶剂进行了提取，从测定的结果可以看出，常规水煮法提取率最低，连续回流提取法提取率最高，所以，如果不是从中药方剂中各药的君臣佐使互相作用水煎煮去使用的话，在元胡提取时，还是采用连续回流提取法效果好，使药物的有效成分能被充分利用.