超效液相色谱串联质谱法测定保健品中阿托品

◎ 刘岑岑，黄延盛，汪晨霞，陈贝贝，谭希明

（1.无限极（中国）有限公司，广东 广州 511447；2.广州质量监督检测研究院，广东 广州 511447）

阿托品是存在于植物体内的一种生物碱，具有显著的生物活性，可用于镇静、止痛，但同时它也具有一定的毒性，可能会引起中枢神经中毒[1]。

近年来，随着经济的飞速发展，人们越来越注重生活质量，使得保健品具有极其广阔的市场前景。但在利益驱使下，有一些不法商家可能会违规添加阿托品用于缓解胃溃疡[2]，但若添加过量，将对消费者的健康造成伤害，因此保健品的安全问题引起了广泛关注。但目前针对保健品中阿托品的检验方法涉及较少，因此建立一个高效的针对保健品中阿托品的检测方法对于严格控制保健品质量具有非常重要的意义。

目前，应用于生物碱检测的主要方法包括薄层色谱法（TLC）[3]、高效液相色谱法（HPLC）[4]、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[5]和高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[6]等，电喷雾质谱技术具有灵敏度高、专属性强的优点，因此本研究采用超声快速提取样品，建立了一种同时测定保健品中阿托品的UPLC-MS/MS方法。

称取适量硫酸阿托品标准品用乙腈配置成标准储备液（1000 μg/mL）。吸取适量的标准储备液用空白基质提取液稀释定容，得到浓度为0.5、1.0、5.0、10、20 μg/L和50 μg/L的系列标准工作溶液。

1.3 实验方法

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪及TSQ Endura三重四级杆质谱仪（美国Thermo公司），MS3涡旋仪（德国IKA公司），KQ-250DV数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），3K15 离心机（德国Sigma公司），Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）。

硫酸阿托品（CAS：55-48-1）标准品的纯度均大于98%，乙腈、甲酸（均为色谱级）购自美国Merck公司。

1.2 标准溶液的配制

1.3.1 样品提取

称取0.5 g（精确至0.001 g）研磨成粉末的样品于10 mL具塞比色管中，加入8 mL 0.1%甲酸水-乙腈（3∶1，v/v）涡旋混匀，超声萃取15 min，然后用0.1%甲酸水-乙腈（3∶1，v/v）定容至10 mL。2500 r/min离心2 min，取1.0 mL上清液上机。

1.3.2 检测条件

色谱柱：Waters ACQUITY HSS T3 液相色谱柱（2.1 mm×100 mm×1.8 µm）；流动相：A为0.1%甲酸水，B为0.1%甲酸乙腈，洗脱程序：0～6 min，70% A；柱温30 ℃；进样量为10 μL；流速0.3 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI+）；数据采集：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：4000 V；离子化温度：350 ℃，辅助气流速：12 L/min；喷雾器温度：400 ℃，鞘气流速：30 L/min；碰撞气：氩气，1.0 mTorr；其他质谱信息见表1。

表1 6种生物碱的质谱参数表

2 结果与讨论

2.1 检测条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

在多反应监测模式下，对阿托品的质谱条件进行优化。结果得出阿托品易在ESI+模式下得到[M+H]+准分子离子峰，质谱信号响应较强。然后选择该特征准分子离子峰为母离子进行二级质谱分析，以响应值最大的碎片离子定为定量离子，次级响应最大的碎片离子定为定性离子，优化射频电压及碰撞能等质谱参数。在此条件下阿托品的色谱图如1所示。

图1 阿托品的MRM色谱图

2.1.2 色谱柱的选择

本实验选择兼容水相好，有封端封尾的Waters ACQUITY HSS T3柱进行分析，阿托品保留效果好，峰形对称。

2.1.3 流动相的优化

在电喷雾质谱正离子模式下流动相中加入酸性介质，有利于被测组分的离子化，从而提高其质谱响应和检测灵敏度。因此本实验选用乙腈-0.1%甲酸-水体系作为洗脱溶剂。

2.2 实验方法的优化

2.2.1 样品提取溶剂

阿托品呈碱性，可用酸性溶剂提取，因此选用0.1%甲酸水-乙腈混合溶剂对样品进行提取。探讨了0.1%甲酸水-乙腈不同配比对目标物的提取效果，如图2所示。结果表明，随着混合溶剂体系中水相的增大，提取回收率在逐渐增加，用0.1%甲酸水∶乙腈=3∶1提取回收率可满足检测要求，因此选用该比例混合溶剂为保健品中目标物的提取溶剂。

图2 不同提取溶剂回收率对比图

2.2.2 样品提取方式

考虑到保健品的形态多样，样品在提取溶剂中不易分散，因此采用超声水浴提取，操作简单，可帮助样品分散均匀、提高提取效率。本实验研究了不同超声时间对目标物提取效率的影响，结果显示，随着超声时间的延长，目标物的提取回收率增加显著，到15 min后开始变化不大，这说明超声时间大于15 min后，样品的萃取过程已趋于一定的平衡，因此选择15 min为实验的超声时间。

2.3 方法学技术指标考察

2.3.1 基质效应

采用空白基质提取液配制标准工作液，这样标准工作溶液和样品溶液都具有相似的基质环境，从而确保线性方程的适用性。

2.3.2 线性范围及方法检出限

测定0.5～50 μg/L系列标准工作混合溶液，以目标物的质量浓度x（μg/L）为横坐标，质谱响应（y）为纵坐标，得到阿托品线性回归方程y=4683.26x-23.14，并计算得出方法的检出限（MLODs，S/N=3）为 10 μg/kg。

2.3.3 方法精密度及回收率

在最优的实验条件下，选取胶囊、口服液、片剂3种基质进行添加回收实验，添加3个加标浓度，每个加标浓度平行测定6次，计算回收率及其相对标准偏差。结果如表2所示，3个添加浓度的回收率在85.5%～95.4%，相对标准偏差在2.1%～5.3%。

表2 5种生物碱加标回收率及精密度表（n=6）

2.4 实际样品测定

随机购买了本市市售的口服液、片剂和胶囊共20种不同类型的保健品采用本方法进行检测，均未检出阿托品。

3 结论

本文选用超高效液相色谱-串联质谱联用技术，开发了一个测定保健品中阿托品的方法。通过优化色谱条件和质谱参数得到了最优的检测条件。该方法样品前处理操作简单；阿托品检测线性范围宽、灵敏度高、检出限低；所测结果准确度高、重现性好，可为保健品的质量安全监管提供技术支持。