对叶百部药材中四种主要生物碱的分布规律

冯天龙，黄灵芳，许翔鸿，张 勉

(中国药科大学 生药学研究室，江苏 南京 211198)

中药百部为百部科植物直立百部 [Stemonasessilifolia(Miq.) Miq. ]、蔓生百部 [S.japonica(Bl.) Miq. ]或对叶百部 (S.tuberosaLour.)的干燥块根，是历版《中国药典》收载的传统止咳、杀虫中药[1]。百部主要活性成分为结构特异的百部生物碱，迄今已分离得到200余种该类生物碱[2-3]。百部药材化学成分多样[4-5]，不仅3种不同基原百部的成分差异极大[6]，就是同种基原百部的生物碱种类也变异很大[7]，难以找到共有成分以建立质量标准。

为了了解百部商品药材的现状，本课题组历时多年从全国各地收集了83批的百部药材，对其进行了基原鉴定，改进了前人的提取和色谱条件[6-7]，采用简易的等度洗脱HPLC-ELSD方法测定了金刚大碱、百部新碱、新对叶百部碱和对叶百部碱的含量，并对4种生物碱在百部药材中的分布进行了分析。

1 实验仪器与材料

1.1 实验仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(含G1311B型四元泵，G1329B型自动进样器，美国安捷伦公司)；Alltech 3300 ELSD检测器；十万分之一、万分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；KH-500DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；KUBOTA 3700微量冷冻离心机(日本久保田公司)。

1.2 实验材料

83批百部药材购自全国各地药材市场与药房，经作者鉴定均为百部科植物对叶百部 (StemonatuberosaLour.)的干燥块根。金刚大碱、百部新碱、新对叶百部碱、对叶百部碱均由课题组分离得到，经HPLC归一法测得金刚大碱、新对叶百部碱和对叶百部碱纯度均≥98%，百部新碱纯度≥91%(极不稳定)。甲醇(色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司)，三乙胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2 实验方法

2.1 对照品溶液制备

精密称取金刚大碱(JGD)、百部新碱(BBX)、新对叶百部碱(XDY)、对叶百部碱(DY)适量，配置成浓度为1.095、1.161、1.100和1.072 mg/mL的对照品储备液。将对照品储备液稀释2倍，制成对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

精密称取对叶百部药材粉末(过60目筛)0.5 g，置50 mL离心管中，加入88%甲醇19 mL，密封，超声提取25 min，重复两次，离心取上清，合并旋干，残渣以少量甲醇溶解转移至10 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤即得。

2.3 色谱条件

色谱柱为Agilent Extend C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流动相为0.1%三乙胺(A)-甲醇(B) (43∶57)，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温30℃。ELSD检测器漂移管温度80 ℃，氮气流速2.1 mL/min，增益为8。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

精密称取配制好的4种生物碱对照品储备液，依次稀释成系列浓度，进样、测定峰面积。以溶液浓度(M)的对数值为横坐标，以峰面积(Y)的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，计算各成分的回归方程及相关系数。金刚大碱回归方程为LgY=1.485 7 LgM+4.043 9，线性范围0.034～1.095 mg/mL，R=0.999 6；百部新碱回归方程为LgY=1.571 7 LgM+ 4.020 5，线性范围0.036～1.161 mg/mL，R=0.999 9；新对叶百部碱回归方程为LgY=1.452 5 LgM+ 4.122 5，线性范围0.034～1.100 mg/mL，R=0.999 7；对叶百部碱回归方程为LgY=1.697 2 LgM+ 4.173 4，线性范围0.034～1.072 mg/mL，R=0.999 7。4个生物碱在所研究的浓度范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度、稳定性和重复性

按照常规方法进行试验，其RSD均符合要求。

2.4.3 加样回收率

分别精密称取已知金刚大碱含量的同一药材样品和已知百部新碱、新对叶百部碱和对叶百部碱含量的同一药材样品各6份，每份0.25 g，分别加入与其含量等量的4种生物碱对照品，平行制备供试品溶液，按2.3项下的色谱条件测定。研究结果表明，金刚大碱、百部新碱、新对叶百部碱和对叶百部碱的平均回收率为99.2%、101.0%、98.3%和98.5%，RSD分别为4.16%、3.65%、3.30%和3.94%。

3 实验结果与讨论

百部由于自身所含化学成分的多变性，难以制定统一的质量标准，因此历版《中国药典》包括2015年版“百部”项下均未包括“含量测定”项。本课题组多年来收集了来自全国各地的83批百部商品药材，时间跨度从2011—2017年，应该具有一定的代表性。经鉴定发现其基原均为对叶百部，说明对叶百部可能是目前市场上百部类药材的唯一基原。本论文在前人研究基础上，改进了方法，测定了对叶百部中4个主要成分的含量。

3.1 对叶百部药材中4种生物碱的含量

按照建立的方法对83批对叶百部药材中金刚大碱、百部新碱、新对叶百部碱和对叶百部碱的含量进行了测定，测定结果见图1和表1。含量测定结果显示，含有金刚大碱的药材27批，含量为1.19～9.13)mg/g，平均含量为1.98 mg/g；含有百部新碱的药材48批，含量为1.41～12.48 mg/g，平均含量为4.75 mg/g；含有新对叶百部碱药材22批，含量为1.27～8.87 mg/g，平均含量为3.73 mg/g；含有对叶百部碱药材48批，含量为2.12～13.83 mg/g，平均含量为5.34 mg/g；4种生物碱含量的总和为1.41～13.83 mg/g，平均总含量为7.47%。

由此可见，除金刚大碱外，其余3种生物碱的含量呈现两极分化，由于少数高含量药材的存在，使4种生物碱总和的平均值(7.47%)远高于各单一生物碱的平均含量。若采用4种生物碱总和平均值下浮20%(5.98 mg/g)进行质控，约1/3的药材低于该含量，包括较多含量在5.0 mg/g左右的仅含单一生物碱的药材，因此即使采用多种生物碱总和的方法来制定百部药材的含量标准也不合理。

A为4个对照品；B-C分别为样品S62、S10；1-金刚大碱，

表1 对叶百部中金刚大碱、百部新碱、新对叶百部碱和对叶百部碱的含量 mg/g

续表1

编号购买地时间产地JGDBBXXDYDY合计S21山东临沂2011.08不详-2.871.353.948.16S22山东烟台2011.08不详-2.504.042.408.94S23湖北通山2011.08不详-2.082.192.606.87S24河南新乡2011.08不详1.477.19--8.66S25安徽霍山2011.08不详-6.82--6.82S26山东招远2011.08不详-6.671.272.5410.48S27湖北荆州2011.08不详1.23-3.283.568.07S28河南醴陵2011.08不详-2.57-9.5412.11S29山西大同2011.08不详--3.962.406.36S30广东广州2011.08不详1.81--2.844.65S31福建厦门2011.08不详-3.36-4.057.41S32海南海口22011.08不详4.741.97--6.71S33广西南宁2011.08不详--1.644.045.68S34河北安国2014.09四川1.294.00-3.468.75S35河北安国2014.09湖南/湖北--8.00-8.00S36河北安国2014.09广西-2.613.902.128.63S37河北安国2014.09广西1.2212.48--13.70S38河北安国2014.09广西---13.8313.83S39河北安国2014.09广西1.21-2.305.288.79S40河北安国2014.09广西---2.292.29S41河北安国2014.09广西-4.58--4.58S42河北安国2014.09湖南---6.206.20S43河北安国2014.09越南--3.592.866.45S44河北安国2014.09重庆1.199.35--10.54S45安徽亳州2014.09不详1.402.43-8.8312.66S46安徽亳州2014.09云南1.323.28-5.8710.47S47安徽亳州2014.09湖北-7.41--7.41S48安徽亳州2014.09湖北---8.608.60S49安徽亳州2014.09湖北1.29--4.916.20S50安徽亳州2014.09江西---9.099.09S51安徽亳州2014.09湖北1.243.88-4.789.90S52安徽亳州2014.09湖北---6.376.37S53广西玉林2016.07云南3.23--2.765.99S54广西玉林2016.08云南---3.773.77S55广西玉林2016.08广西桂林1.205.073.58-9.85S56广西玉林2016.08广西百色-2.68-7.179.85S57广西玉林2016.08广西百色-1.48--1.48S58广西玉林2016.08广西百色-3.13--3.13S59广西玉林2016.08广西靖西2.245.47--7.71S60广西玉林2016.08海南--8.87-8.87S61广西玉林2016.08广西防城港1.98--2.924.90S62广西玉林2016.08广西桂林9.13---9.13

续表1

编号购买地时间产地JGDBBXXDYDY合计S63广西玉林2016.08广西玉林-11.58--11.58S64广西玉林2016.08广西容县--4.41-4.41S65广西玉林2016.08贵州--2.59-2.59S66广西玉林2016.08贵州--8.61-8.61S67广西玉林2016.08广西平南---4.154.15S68广西玉林2016.08广西柳州-1.41--1.41S69广西玉林2016.11广西玉林---11.9811.98S70广州清平2017.03云南1.402.80-4.338.53S71广州清平2017.03安徽1.457.96--9.41S72广州清平2017.03四川-2.35-2.604.95S73广州清平2017.03湖北1.954.37--6.32S74广州清平2017.03广西---6.986.98S75湖北宜昌2017.06湖北宜昌-7.48--7.48S76湖北宜昌2017.06湖北宜昌1.957.42--9.37S77四川达州2017.06四川达州-3.08--3.08S78四川达州2017.06四川达州-9.07--9.07S79云南普洱2017.06云南普洱---8.588.58S80湖北宜昌2017.06湖北宜昌-4.77--4.77S81越南2017.06越南--4.30-4.30S82缅甸2017.06缅甸-4.83--4.83S83越南2017.06越南---6.166.16平均1.984.753.735.347.47

注：“-”为低于检测限；JGD:金刚大碱，BBX:百部新碱，XDY:新对叶百部碱，DY:对叶百部碱。下表同

3.2 对叶百部药材中4种生物碱的分布方式

从83批药材中4种生物碱的分布(图2)来看，含有百部新碱(48；表示药材批次，下同)和对叶百部碱(48)的药材批次较多，含金刚大碱(27)和含新对叶百部碱(22)的药材批次较少。从药材中含有的生物碱数目来看，38批药材含有单一生物碱，约占总批次的45.8%；28批药材含有两种生物碱，约占总批次的33.7%；17批药材含有三种生物碱，约占总批次的20.5%；没有发现同时含有4种生物碱的药材。这个结果或多或少地说明百部生物碱的分布具有趋单性，含有1～4种生物碱的药材比例呈现依次递减的趋势(45.8%→33.7%→20.5%→0%)，含2种以上生物碱的药材仅占54.2%。

3.3 对叶百部药材中2种以上生物碱同时出现的概率分析

对含有特定生物碱药材中其他成分出现的概率进行了分析(表2)。含有金刚大碱的27批药材中，单含金刚大碱的可能性仅3.7%，大多数情况下会同时含有百部新碱(59.3%)或对叶百部碱(59.3%)；含有百部新碱的48批药材中，同时含有对叶百部碱的概率最高(41.7%)，其次是单含百部新碱(35.4%)或同时含有金刚大碱(33.3%)的药材；含有新对叶百部碱的22批药材中，同时含有对叶百部碱的概率最高(63.6%)；而含有对叶百部碱的48批药材中，同时含有百部新碱的概率最高(41.7%)。该结果可用于对照品短缺情况下对叶百部药材化学成分的预测。

J、B、X、D分别为金刚大碱、百部新碱、新对叶百部碱和对叶百部碱

图2对叶百部药材中4种生物碱的分布方式

表2 对叶百部药材中4种生物碱出现的概率

注：a表示仅含有JGD；b表示含有JGD+BBX、JGD+BBX+(XDY或DY)

3.4 对叶百部药材中4种生物碱的分布与购买地关系浅析

虽然以上4种成分都具有镇咳作用，但Xu等[8]研究表明，金刚大碱可以透过血脑屏障而影响中枢神经，因此金刚大碱可能具有一定的毒性或杀虫活性，可能与百部的“有小毒”相关。根据使用目的，有时需要定向选择或者避开含有某些特定主成分的药材。从主要购买地来看，购于河北安国市场的药材，对叶百部碱所占比例较高，其余三种生物碱所占比例接近；购于安徽亳州市场的药材，对叶百部碱所占比例较高，但不含新对叶百部碱；购于广西玉林市场的药材，4种生物碱所占比例接近；购于广州清平市场的药材，除不含新对叶百部碱外，其余三种生物碱所占比例较为接近。考虑到各药材市场货源的相对稳定性，该结果对于购买特定生物碱的百部药材具有一定的指导意义。

总之，本文测定了不同时间收集的83批来自全国各地的对叶百部商品药材，经鉴定全为对叶百部；含量测定结果表明，虽然对叶百部的化学成分复杂多变，难以建立统一的质量标准，但每批百部药材至少含有金刚大碱、百部新碱、新对叶百部碱和对叶百部碱四者之一。