响应面法优化壳聚糖/香榧假种皮精油复合涂膜保鲜剂的配方

李 彪，倪伟超，倪 穗

(宁波大学 海洋学院，浙江 宁波 315211)

壳聚糖是甲壳素脱乙酰的产物，是一种可生物降解材料，由于自身的正电荷可以干扰微生物细胞表面的负电荷进行物质交换，导致细胞膜破裂，从而具有一定的抑菌性。壳聚糖不溶于水，溶于多数有机酸形成粘稠液体并具有良好的成膜性，同时壳聚糖具有良好的生物相容性，研究人员曾把茶多酚、石榴皮提取物、薄荷提取物和花青素等天然活性物质与壳聚糖混合研制出具备一定性质的保鲜膜的研究[1-2]，其具有很大的应用价值。香榧假种皮精油是天然的活性物质，具有较强的抑菌性和抗氧化性，结合壳聚糖的成膜性，研制出一种果蔬保鲜剂具有很大的开发潜力。

香榧(TorreyagrandisFort. ex Lindl. cv. Merrillii)是红豆杉科(Taxaceae)榧属(Torreya)植物，其种子是我国特有的珍稀干果。香榧营养价值很高，富含脂肪、蛋白质、糖分以及钙、钾、锌、磷等多种矿物元素，还含有多种维生素和17种氨基酸[3]，香榧假种皮中含有多种黄酮类化合物、醇、醛、烯等植物芳香类物质，具有较强的抗氧化活性[4]。动物实验表明，香榧假种皮提取物具有消炎作用[5]。同时，这类植物精油对微生物具有广谱性、高效性，具有很强的杀菌作用，可以有效的杀死多种果蔬表面的有害微生物，结合壳聚糖的成膜性，两者搭配使用则是一种安全无毒的天然保护剂。李湘利[6]等研究了姜蒜浸取液与壳聚糖复合保鲜剂对切分莲藕的护色效果，结果表明复合保鲜剂可显著抑制切分莲藕贮藏期间的PPO和MDA的积累，延长货架期。陶永元[7]等利用壳聚糖与茶多酚复配对草莓进行保鲜，结果表明明显降低草莓的失重率、腐烂指数、呼吸强度，延缓果实的维生素C、可滴定酸、可溶性糖含量的下降，保持较好的感官品质。茶多酚与壳聚糖复合物对草莓具有明显的保鲜效果。

本论文研究内容是以壳聚糖为成膜机制，甘油为增塑剂，再添加香榧假种皮精油这种天然物质，以期制备出一种抗菌抗氧化的果蔬保鲜剂。通过响应面设计实验，探究壳聚糖、香榧假种皮精油、甘油三者之间不同配比对抑菌性和抗氧化性的影响，利用Design-Expert软件优化得出复合涂膜的最佳配比，为工业化生产壳聚糖/香榧假种皮精油复合涂膜保鲜剂提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

壳聚糖，脱乙酰度为95%，购买自厦门蓝湾科技有限公司。香榧假种皮精油采用水蒸气蒸馏法获得。甘油(丙三醇)、冰醋酸、乳酸、吐温-80等均为分析纯药品。

1.2 实验设备

挥发油提取装置(郑州中天实验仪器有限公司)；电炉，多功能粉碎机(上海江信科技有限公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超净工作台(天津市泰勒斯仪器有限公司)；电热恒温培养箱(天津市泰勒斯仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计(北京普系统用仪器有限公司)；HH-S4数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。

1.3 复合涂膜的制备工艺

按照实验配比，分别将一定量的壳聚糖溶于含有1%乙酸和1%的乳酸溶液中，将一定量的香榧假种皮精油添加到溶液中，再加入一定量的甘油和0.2%吐温-80，搅拌至完全溶解。

1.4 单因素实验的设计

固定壳聚糖浓度为2%，甘油浓度为2%，比较不同的香榧假种皮精油浓度(0，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%)对复合涂膜的抑菌性和总酚含量的影响。

固定香榧假种皮精油浓度为0.6%，甘油浓度为2%，比较不同的壳聚糖浓度(0，1%，1.5%，2%，2.5%，3%)对复合涂膜的抑菌性和总酚含量的影响。

固定香榧假种皮精油浓度为0.6%，壳聚糖浓度为2%，比较不同的甘油浓度(0，2%，3%，4%，5%)对复合涂膜的抑菌性的影响。

1.5 双响应面法优化壳聚糖/香榧假种皮精油复合涂膜保鲜剂的配比

在单因素实验的基础上，根据响应面法的中心组合实验(Box-Beknken)设计，挑选出香榧假种皮精油浓度(X1)、壳聚糖浓度(X2)、甘油浓度(X3)三个因素，以-1、0、1分别表示三个因素的低、中、高三个水平，并以保鲜剂中总酚含量(Y1)和抑菌圈大小(Y2)为两个响应值。响应面分析因素及水平如表1所示，每组实验重复三次，取平均值。

表1 响应面分析因素及水平

1.6 总酚含量的测定

没食子酸标准曲线的制备：准确称取没食子酸标准品25 mg，去离子水溶解定容至250 mL，得到对照品标准溶液。精准吸取对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL容量瓶中，再加入2.5 mL、10%的福林酚显色剂，摇匀，5 min后再加入2 mL、7.5% Na2CO3溶液，定容至10 mL。室温下反应1 h后测定溶液在765nm处的吸收峰。标准曲线方程为Y=0.094 5+0.023 5，R2=0.999 5。

按照制备标准曲线的方法测定总酚含量，准确吸取保鲜剂液体1mL，加入2.5 mL去离子水，再加入2.5 mL、10%的福林酚显色剂，摇匀，5 min后再加入2 mL、7.5% Na2CO3溶液，定容至10 mL。室温下反应1 h后测定溶液在765 nm处的吸收峰。取3个平行组，每组测3次。

1.7 抑菌圈的测定

菌种的活化：金黄色葡萄球菌经营养琼脂培养基斜面(37±1)℃培养24 h活化，挑取单菌落接入无菌新鲜液体培养基(37±1)℃培养24 h，用接种环挑取1环在平板上划线培养，恒温培养箱培养12 h，然后挑取单菌落，采用十倍稀释法将菌液稀释至所需浓度。

用无菌移液枪吸取0.1 mL菌悬液(菌液浓度106cfu/mL)，加入已倒好培养基的培养皿中涂布均匀。每个培养皿放置已灭菌的牛津杯2个，在每个牛津杯中加入300 μL配置好的保鲜剂。将培养皿置于37 ℃恒温恒湿培养箱中培养24 h，采用十字交叉法测定抑菌圈直径。每组试验重复3次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 香榧假种皮精油浓度对复合涂膜的抑菌性和总酚含量的影响

在壳聚糖浓度为2%，甘油浓度为2%的条件下，不同精油浓度对复合涂膜的抑菌性和总酚含量的影响如图1所示。

图1 精油浓度对复合涂膜的抑菌性和总酚含量的影响

由图1可知，随着精油浓度的升高，复合涂膜的总酚含量在升高，抑菌性也在增强。当精油浓度0.6%时，复合涂膜的总酚含量和抑菌性增加非常缓慢，因此综合考虑到精油资源的珍贵性，精油的最佳浓度选取为0.6%。

2.1.2 壳聚糖浓度对复合涂膜的抑菌性和总酚含量的影响

在香榧假种皮精油浓度为0.6%，甘油浓度为2%的条件下，不同壳聚糖浓度对复合涂膜的抑菌性和总酚含量的影响如图2所示。

图2 壳聚糖浓度对复合涂膜的抑菌性和总酚含量的影响

由图2可知，随着壳聚糖浓度的增大，复合涂膜的总酚含量和抑菌性都呈现出先增大后减小的趋势。当壳聚糖浓度超过2%时，复合涂膜的总酚含量和抑菌性开始下降，可能是由于壳聚糖浓度过高，使得液体粘稠性过大，精油无法与壳聚糖溶液完全的溶合。因此，最佳的壳聚糖浓度为2%。

2.1.3 甘油浓度对复合涂膜的抑菌性的影响

在香榧假种皮精油浓度为0.6%，壳聚糖浓度为2%的条件下，不同甘油浓度对复合涂膜的抑菌性的影响如图3所示。

图3 甘油浓度对复合涂膜的抑菌性的影响

由图3所示，随着甘油浓度的增大，复合涂膜的抑菌性能呈现出增加趋势，但是当甘油浓度大于2%时，复合涂膜的抑菌性就开始下降，因此最佳的甘油浓度为2%。

2.2 响应面法优化壳聚糖/香榧假种皮精油复合涂膜保鲜剂的配比

在前期单因素实验的基础上，选取了香榧假种皮精油浓度(X1)、壳聚糖浓度(X2)、甘油浓度(X3)三个因素作为变量，以复合涂膜的总酚含量(Y1)和抑菌性(Y2)作为两个响应值，其设计方案及结果如表2所示。

表2 响应面试验设计方案及结果

为了明确各因素对响应值的影响，对表2进行数据回归拟合，得到复合涂膜的总酚含量和抑菌性与三个因素之间的二次方程模型：Y=2.46+0.072X1-6.25×10-4X2+0.032X3-0.058X1X2-0.014X1X3-0.059X2X3-0.12X12-0.19X22-0.14X32。

从表3可以看出，该模型的F值为13.88，P=0.001 1<0.01，说明了该模型极显著，具有统计学的意义，且回归模型的失拟项P=0.149 3>0.05差异检验不显著，表明所选用的二次回归方程模型与实验数据拟合较好，实验误差小。回归方程的拟合程度可以通过决定系数R2和校正决定系数RAdj2来验证。该模型决定系数R2=0.946 9，校正决定系数RAdj2=0.932 8，表明该模型拟合程度良好。因此该模型方程可用于优化壳聚糖/香榧假种皮精油复合涂膜保鲜剂的配比。

表3 回归方程方差分析

由表3中方差分析结果可知，在所选因素水平范围内对复合涂膜配比的影响大小顺序为X1>X2>X3，即精油浓度>壳聚糖浓度>甘油浓度。该模型中一次项X1(精油浓度)对模型有极显著的影响，X2(壳聚糖浓度)对模型有显著影响，X3(甘油浓度)对模型影响不显著；二次项X12、X22、X32对模型都有极显著的影响；交互项X1X2、X1X3、X2X3之间的交互作用都不显著，表明各因素对复合涂膜最佳配比的影响并不是简单的线性关系。

2.3 壳聚糖/香榧假种皮精油复合涂膜保鲜剂的最佳配比的确定与验证

根据模型多元回归方程所作的响应面曲线及等高线图见图4～9，可以直观的反应各因素之间的交互作用。6个曲面均为开口向下的凸形曲面，因素X1、X2、X3与复合涂膜的总酚含量和抑菌性均呈现抛物线关系，且存在考察范围内的极大值。

对所得到的模型回归方程3个自变量取一阶偏导数等于零，可得X1=0.7、X2=2.01、X3=2.14，因此根据响应面分析结果预测壳聚糖/香榧假种皮精油复合涂膜保鲜剂的配比的最优条件为精油浓度为0.7%、壳聚糖浓度为2.01%，甘油浓度为2.14%，在此条件下预测的总酚含量为31.61×10-3mg/mL，抑菌圈为2.42 cm。

图4精油浓度和壳聚糖浓度对复合涂膜总酚含量影响的等高线和三维曲面

未检验此结果的准确性，采用上述工艺条件进行总酚含量和抑菌性的实验。香榧假种皮精油浓度为0.7%，壳聚糖浓度为2.01%，甘油浓度为2.14%配制的复合涂膜进行实验，得到的总酚含量为30.23×10-3mg/mL，与预测值的误差为4.37%，抑菌圈为2.35 cm，与预测值的误差为2.89%。因此，该模型得到的壳聚糖/香榧假种皮精油复合涂膜保鲜剂的最佳配比准确可靠，具有实用价值。

3 结 论

壳聚糖以其独有的无毒性、可降解性、广谱抗菌性和成膜性等特点，被广泛的应用于果蔬保鲜，延长货架期等领域。本章内容就是利用壳聚糖的特点来制备出一种抗菌抗氧化的果蔬保鲜剂。

在单因素的基础上，采用了响应面法对壳聚糖/香榧假种皮精油复合涂膜保鲜剂的配比进行优化以其得到低成本高效的保鲜剂。选取香榧假种皮精油浓度、壳聚糖浓度、甘油浓度作为自变量，以复合涂膜中的总酚含量和抑菌性作为响应值，采用 Box-Behnken进行三因素三水平试验设计。结果表明：精油浓度对复合涂膜有极显著影响，壳聚糖浓度对复合涂膜有显著影响，甘油浓度对复合涂膜影响不显著，三个因素对保鲜剂的影响大小顺序依次为香榧假种皮精油浓度>壳聚糖浓度>甘油浓度；壳聚糖/香榧假种皮精油复合涂膜保鲜剂的最佳配比是香榧假种皮精油浓度为0.7%，壳聚糖浓度为2.01%，甘油浓度为2.14%，在此条件下复合涂膜的总酚含量为30.23×10-3mg/mL，与预测值的误差为4.37%，抑菌圈为2.35 cm，与预测值的误差为2.89%。

总之，优化后的复合涂膜弄够合理的使用精油资源，不仅使香榧假种皮这种资源不再污染环境，而且还可以给农民带来一定的收入，最主要的是添加到了保鲜剂中可以有效地抑制果蔬上微生物的生长，减少浪费。