一株生防芽孢杆菌的分离与鉴定

广泽宇

（中国农业大学烟台研究院，山东 烟台 264003）

植物病害一直在农业生产中有较大影响，化学防治是控制植物病害的有效方法，其具有见效快、杀菌谱广、成本低、使用简便等优点［1］，但长期大量使用化学农药致使病原菌产生了耐受性，并且农药对人、畜和环境都有一定的危害。随着近年来人们对食品安全及环境污染问题关注度的提高，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已被严格限制使用［2］。生物防治技术是一种无残留无污染、不杀伤天敌、不会产生抗药性［3］、有利于人畜安全及环境保护的无公害环保技术，有利于提高经济、社会、生态效益，有广阔的发展前景［4］。因此，生物防治尤其是微生物防治在将来可能替代化学药剂成为一个环保安全的选择［5］。

本研究旨在从植物根际土壤中分离筛选对植物病原微生物具有生防作用的芽孢杆菌，对其进行鉴定。分离筛选出高效生防的芽孢杆菌，为以后拮抗型生物肥料以及生物农药的生产提供高效的菌种，同时为菌种的工业化发酵生产提供科学的试验数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试植物病原菌株。立枯丝核菌Rhizoctoniasolani、葫芦科刺盘孢Colletotrichumlagenarium、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、玉蜀黍离蠕孢（Bipolarismaydis）、链格孢（AlternariaNees）、尖孢镰刀（Fusariumoxysporum）、腐皮壳霉（Fusariumsolani）、交链孢霉（Alternaria sp.），试验室保藏。

1.1.2 主要试剂NA。固体培养基、NB液体培养基、马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、FastDNA™SPINKitfor SoilDNA试剂盒，Trans2KPlusⅡ DNAMarker、6×DNA LoadingBuffer、Agarose、50×TBE。

1.1.3 仪器设备。生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、霉菌培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、立式压力蒸汽灭菌锅（北京柏莱斯特科技发展有限公司）、核酸蛋白检测仪（北京五洲东方科技发展有限公司）以及梯度PCR仪（上海拜力生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤中芽孢杆菌的分离与纯化。从中国农业大学烟台研究院校内菜地采集土样，阴干研磨后称取10g，放入100mL无菌水于250mL三角瓶中，摇动3～5min，在80℃水浴中加热10min［6］。梯度稀释涂布于营养琼脂平板，28℃培养48h。挑取单菌落、镜检，根据单菌落大小、表面结构、质地、光泽和颜色等特征，挑取菌落形态差异明显的单菌落，采用划线分离的方法纯化，将已纯化的菌株保存于NA培养基斜面备用［7］。

1.2.2 拮抗菌株的筛选。对分离纯化到的芽孢杆菌，以供试病原真菌为靶标，采用平板对峙培养法［8］，用皿内琼胶平板直接测定。逐日观察菌落的生长和细菌的抑制作用，选择拮抗性好的菌株进入复筛。以初筛结论为基础，在PDA平板中心先接种病原菌，一两天后在四周接种同一种芽孢杆菌菌株，两者相距5cm，3次重复，分别以细菌和病原菌在PDA上的纯培养为对照，28℃培养，逐日观察菌落的生长和细菌的抑制作用，筛选生长速度快、抑制率高的菌株。

1.2.3 生防芽孢杆菌优良菌株的初步鉴定

1.2.3.1 培养特征的观察。参照《常见细菌系统鉴定手册》［9］中的形态学指标，将菌株分别接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，倒置于30℃的恒温培养箱中培养48h，观察生防菌株在培养基上的菌落的生长情况。

1.2.3.2 菌体形态的观察。挑取在斜面培养48h的生防芽孢杆菌菌落于载玻片上，分别进行革兰氏染色、芽孢染色、及荚膜染色，并在显微镜下观察拮抗菌的大小和形态。

1.2.3.3 16SrRNA基因的扩增与测序。将菌种接种于LB液体培养基中，37℃温度，200r/min过夜培养，12000r/min离心收集菌体，用FastDNATMSPINKitfor Soil试剂盒提取细菌基因组DNA。使用细菌16SrDNA通过引物27F和1492R对提取的基因组DNA进行PCR扩增［10］。PCR产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1.2.3.4 序列分析和系统发育树构建。根据16sSrRNA测序结果，登陆NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列相似性比对搜索，从中获得相似性较高的典型菌株序列作为参比对象，用MEGA8.0生物软件进行多序列比对并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 拮抗芽孢杆菌的分离筛选

本试验共分离纯化芽孢杆菌33株，经平板对峙试验筛选出对病原菌具有拮抗作用的菌株6株，其中菌株B-Q4对立枯丝核菌、玉蜀黍离蠕孢、腐皮壳霉、交链孢霉均具有良好的拮抗作用，确定为最优菌株（如图1所示）。

2.1.1 培养特征观察结果。B-Q4在NA培养基平板上菌落为圆形或近圆形，直径5mm，乳白色，质地软、无色素、稍有光泽，表面有褶皱，蜡质，边缘不整齐（如图2所示）。

图2 菌株在平板上的菌落特征

2.1.2 菌体形态观察结果。B-Q4菌体呈短杆状，在电子显微镜下大小为（1.0～1.2）μm×（3.0～4.0）μm，培养48h后产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5μm，孢囊无明显膨大。革兰氏阳性，无荚膜（如图3所示）。

图3 B-Q4菌体形态（电子显微镜下）

2.2 基因组DNA的提取及16SrDNAPCR扩增

利用FastDNATMSPINKitforSoil试剂盒提取的细菌基因组DNA，经过PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳检测（如图4所示），获得了约1500bp的条带。

图4 PCR产物电泳图谱

注：M为Trans2KPlusⅡDNAMarker分子量标准1为B-Q416SrDNAPCR扩增产物。

2.3 16SrDNA序列分析比对结果

以B-Q4基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到的特异16SrDNA片段长度为1434bp（如图5所示），将B-Q4菌株的16SrDNA测序结果在NCBI中进行Blast比对，结果表明，B-Q4菌株与BacilluscereusSP31的序列相似性达到99%，通过MEGA5.0软件构建系统进化树，结果显示菌株B-Q4都与Bacilluscereus亲缘关系最近。

图5 特异16SrDNA片段长度

3 结论

本试验对B-Q4菌株进行了分子鉴定及其生物学特性的研究。通过16SrDNA序列分析，对B-Q4进行分子鉴定，结果表明，B-Q4为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。B-Q4在NA培养基平板上菌落为圆形或近圆形，乳白色，质地软、无色素、稍有光泽，表面有褶皱，蜡质，边缘不整齐；在斜面上划线培养呈直线生长；在液体培养基中生长，液体混浊具有菌膜。其形态学研究进一步说明B-Q4是蜡样芽孢杆菌。

［1］吴金平，宋志红，向发云，等.拮抗细菌在植物病害生物防治中的抗病机理［J］.湖北农业科学，2009（9）：2286-2288.

［2］FemandoWGD，NakkeeranS，ZhangY，etal.BiologicalcontrolofSclerotiuiasclerotiorum（Lib.）deBarybyPseudomonasandBacilusspeciesoncanolapetals［J］.CropProtection，2007（2）：100-107.

［3］周德庆.微生物学实验手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1986.

［4］马成涛，胡青，杨德奎.土壤有益微生物防治植物病害的研究进展［J］.山东科学，2007（6）：61-66.

［5］张俊华.微生物代谢产物作用于植物的研究探讨［J］.生命科学研究，2007（4）：44-47.

［6］邱德文.我国生物农药现状分析与发展趋势［J］.植物保护，2007（5）：27-32.

［7］罗兰，袁忠林，陈茎.小麦全蚀病菌拮抗细菌的筛选及鉴定［J］.青岛农业大学学报，2006（3）：205-207.

［8］许光辉，郑洪元.土壤微生物分析方法手册「M］.北京：农业出版社，1986.

［9］江木兰，赵瑞，胡小加.油菜内生生防菌BY--2在油菜体内的定殖与对油菜菌核病防治作用［J］.植物病理学报，2007（3）：10.

［10］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册「M］.北京：科学出版社，2001.