甜菜碱型两性离子聚合物的水解及其对抗菌性能影响的研究

刘东立 陈昌林 郎美东

1上海东杰高分子材料有限公司 （上海 201108）2华东理工大学材料科学与工程学院 （上海 200237）

两性离子聚合物独特的两性离子结构使其具有一些独特的性质[1-3]。一方面，两性离子聚合物微凝胶具有与蛋白质核酸等生物大分子相似的分子结构，因而具有良好的生物相容性；另一方面，其分子链上的酸碱基团之间可以形成离子键，与共价键相比，属于弱的相互作用，因此，其对环境的变化更为敏感。

另外，大多数两性离子聚合物链内引入—OH，—COOH，—SO3H及胺基等亲水基团，从而具有良好的抗非特异性蛋白质吸附、抗细菌黏附及抗凝血等性能[4]。两性离子聚合物在分离技术[5]、生物医用材料[6]、医疗器件[7]、药物基因载体[8-11]，尤其在高效防生物污损领域有广泛的应用前景[12]。

聚[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)铵 (PDMAPS,也称PSBMA)和聚[3-(甲基乙烯酰胺)丙基]二甲基-(3-磺酸丙基)铵 (PDMMPPS,也称PSPP)是两类典型的磺酸基甜菜碱型两性离子聚合物。其两性离子基团通过酯键或酰胺键与聚合物主链相连，而这些酯键或酰胺键可水解，水解会使聚合物失去两性离子基团从而失去两性离子聚合物的功能性；但二者的水解性能有明显的差异。由于酯键的稳定性比酰胺键的稳定性差，所以PDMAPS的稳定性比PDMMPPS差：Pascaline Mary[13]报道了经一次透析提纯的PDMAPS的水解率高达13%左右，而带有酰胺键的PDMMPPS只有8%。这说明了无论是PDMAPS还是PDMMPPS，在作为防污抗菌材料应用时，必定会由于水解而失去两性离子基团，从而使防污效果大大下降，而PDMAPS则更为严重，因此，有必要对其水解情况进行进一步的探究。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

1,3-丙磺酸内酯，99%，上海晶纯生化科技股份有限公司；蛋白胨（FP318）、酵母粉（LP0021），安琪酵母股份有限公司；大肠杆菌，生物反应器工程国家重点实验室；乙醇（分析纯）、盐酸（分析纯）、氢氧化钠（98%）、磷酸二氢钾（化学纯），国药集团化学试剂有限公司；氯化钠（99.5%，分析纯），上海泰坦科技股份有限公司；过硫酸钾（分析纯）、亚硫酸氢钠（分析纯）、丙酮（99.5%），上海凌峰化学试剂有限公司；[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]二甲基-(3-磺酸丙基)铵 (DMAPS)、[3-(甲基乙烯酰胺)丙基]二甲基-(3-磺酸丙基)铵（DMMPPS），99.5%，常州一品堂化学有限公司。

1.2 PDMAPS以及PDMMPPS的制备

称取单体DMAPS 3 g，溶解于45 mL的0.1 mol/L的NaCl溶液中，加入到100 mL的反应瓶中；分别称取过硫酸钾8.1 mg和亚硫酸氢钠4.05 mg，溶解后加入到反应瓶中；密封后，反复抽气并通入氩气，以除去反应瓶中及溶液中的氧气；置于30℃的条件下反应8 h左右。PDMMPPS的制备方法同上。

1.3 两性离子聚合物水解实验

1.3.1 PDMAPS和PDMMPPS在不同pH条件下的水解

称取PDMAPS及PDMMPPS各1 g，称量3份，分别溶解于50 mLPBS溶液（磷酸盐缓冲溶液）、50 mL0.1 mol/L的NaOH溶液 (pH=13)以及50 mL0.1 mol/L的盐酸溶液(pH=1)中；准备15支干净的试管，将试管分别编号 A1～A5，B1～B5，C1～C5，然后将50mL聚合物溶液分成5份，每份10 mL，分别装入ABC编号的试管中，A表示PBS溶液，B表示NaOH溶液，C表示盐酸溶液；将这15支试管置于37℃的恒温振荡箱中振荡，每隔10 d依次取出编号1,2,3,4,5的样品，在蒸馏水中透析1 d，冷冻干燥后送核磁检测。

1.3.2 PDMAPS的常温透析水解

称取聚合成功的PDMAPS 2 g，溶解于100 mL0.1 mol/L的NaCl溶液中，配制成0.02 g/mL的聚合物溶液。将聚合物溶液分成2等份，作为平行样作对比。在室温(25℃)条件下，将2份50 mL聚合物溶液分别在0.1 mol/L的NaCl溶液中透析（透析袋能透过分子的相对分子质量低于7000），记录时间，每隔 1 天换一次蒸馏水，分别在第 1，3，6，12，24，48 和96 d取一次样，每次取样5mL左右，取出的样进行冷冻干燥，然后做1H-NMR测试。为防止外界灰尘、空气等条件的干扰，透析过程尽量在恒温的密闭条件下进行。

1.3.3 PDMAPS和PDMMPPS在高温条件下的水解

称取聚合成功的PDMAPS及PDMMPPS各1 g，溶解于50 mL0.1 mol/L的NaCl溶液中，加入到100 mL的烧瓶中，在80℃条件下冷凝回流3 d，然后在蒸馏水中透析1 d，冷冻干燥后送核磁检测。

1.4 抗菌测试

培养基配制：将1 g酵母粉，2 g蛋白胨，2 g Na－Cl，4 g琼脂粉放入锥形瓶中，倒入200 mL去离子水配制成溶液。

培养液配制：将1 g酵母粉，2 g NaCl以及2 g蛋白胨放入锥形瓶中，倒入200 mL去离子水配制成溶液。

无菌水为0.85%的NaCl溶液。

灭菌处理：将做抗菌实验需要的玻璃仪器洗净，然后将其和枪头、离心管（EP管），以及配制好的无菌水、培养液和培养基等放在全自动高压灭菌锅中，在115℃下高压灭菌20 min，取出后放在紫外无菌操作台上，以防止染上杂菌。

大肠杆菌的培养：取4 mL原菌液，滴入到培养液中，密封，这一过程需在无菌台上操作；将培养液放置在恒温振荡箱中振荡5 h，得到阴性大肠杆菌菌液。菌液需要检验大肠杆菌的浓度，其值不能过高或过低。可以取少量菌液，稀释10倍，使用分光光度计测量，吸光度值在0.1～0.2之间比较适宜。

固体培养基的制备：刚灭菌后的高温液体培养基倒入灭菌后的培养皿中，然后放在紫外无菌操作台上让培养皿中的培养基冷却凝固，凝固后盖上培养皿盖倒置以做备用。每个样品需要使用2个固体培养基做平行样，本实验中，有空白对照组，未水解的PDMAPS，12 d常温透析水解的PDMAPS和96 d常温透析水解的PDMAPS共4组样品，所以需要8个培养皿。

抗菌实验步骤：称取未水解的PDMAPS，12 d常温透析水解的PDMAPS和96天常温透析水解的PDMAPS各120 mg，分别加入到已经灭菌的锥形瓶中，编号1，2，3，空白锥形瓶编号为4；取准备好的阴性大肠杆菌菌液20 mL加入到4个锥形瓶中，待产物溶解后，使用棉纱布将瓶口封住，放入ZQLY-180 T振荡培养箱中在37.0℃下培养5 h；取100μL菌液在EP管中使用无菌生理盐水逐步稀释107倍，再取稀释107倍后的菌液100μL逐滴滴在固体培养基表面的中心位置，使用涂布棒将大肠杆菌菌液均匀地涂布在固体培养基表面，然后按照样品的顺序进行编号；将编号后的培养皿倒置放入37.4℃的SPX-300B-G型微电脑光照培养箱中培养18 h，然后取出培养皿，拍照并统计大肠杆菌菌落数目。为确保操作过程中不染菌，整个操作在点燃酒精灯的无菌台上完成，并且需要保证操作过程的规范性。

1.5 测试与分析

采用德国Brucker AVANCE 500超导傅里叶变换核磁共振波谱仪对共聚物进行1H-NMR表征；采用美国Nicolet 5700型傅里叶变换红外光谱仪，使用KBr压片法对样品官能团进行红外表征；采用北京普立泰科仪器有限公司的PL-GPC 50型DMF相凝胶渗透色谱仪进行GPC表征；采用杭州格图科技有限公司的BM-18双目生物显微镜对大肠杆菌在薄膜表面的黏附情况进行观察；采用活菌平板计数法研究薄膜对大肠杆菌的致死率；采用日本理学株式会社的Ultima IV X射线衍射仪进行X射线光电子能谱分析（XPS）。

2 结果与讨论

2.1 两性离子聚合物的制备

PDMAPS和PDMMPPS均为白色块状固体，硬而脆，产率为85%，相对分子质量大约为5万。其化学结构如图1所示。

图 1 DMAPS（a）和 DMMPPS（b）的结构式

2.2 两性离子聚合物的水解

PDMAPS和PDMMPPS均为水溶性两性离子聚合物，二者核磁共振氢谱分别如图2和图3所示。图2 中化学位移：a(2H,1.7～1.9)，b(3H,0.7～1.1)，c(2H,4.2～4.5)，d(2H,3.6～3.8)，e(6H,3.0～3.2)，f(2H,3.4～3.6)，g(2H,2.1～2.3)，h(2H,2.8～3.0)。可以通过 b 峰与 e 峰的强弱来判断聚合物的水解程度。PDMAPS水解前b峰强度与e峰强度之比（b/e）为3∶6，酯键水解断裂并经透析后，e峰削弱，b/e值增大，初始的PDMAPS和水解后b/e值的这种差异可以用来粗略分析其水解率。同理，PDMMPPS也通过这种方法测定水解度。可以令b0=b1=3，则水解率：

式中：b0，e0为未水解 PDMAPS 的 b，e 峰强度；b1，e1为水解后PDMAPS的b,e峰强度。

图2 PDMAPS的1H-NMR谱图

图 3 PDMMPPS 的 1H-NMR 谱图

通过XPS测定聚合物的元素组成，可以较为精确地分析出聚合物的水解程度。理论上，聚合物中各元素的物质的量比为 n（C）∶n（N）∶n（O)∶n(S)=11∶1∶5∶1，水解之后由于酯键的断裂会导致N，S元素比例的减少，通过分析C元素与N元素或S元素的比值[x（C）/x（N）或 x（C）/x（S）]来确定水解率。因为存在一定的系统误差使得初始x（C）/x（N）值不能准确地保证在11，所以计算过程中以初始的XPS中显示的比值为准。计算公式见式（2）。

其中：φ表示水解率；x(C)0，x(C)1表示水解前后C元素的物质的量分数，x(N)0，x(N)1表示水解前后N元素的物质的量分数。

2.2.1 PDMAPS在不同pH条件下的水解结果

在不同pH条件下的水解实验中，设计有3组不同pH的水解溶液，分别为盐酸溶液(pH=1)，PBS溶液(pH=7.4)，NaOH溶液(pH=13)。每组有5组不同时间段的样品，分别为 10，20，30，40 和 50 d。本实验取了第20 d和第40 d的结果做了核磁共振谱图，结果如下。

（1） 酸性条件下的水解

图4反映酸性条件下PDMAPS在第20，40 d时的水解情况。初始PDMAPS核磁共振谱图（见图2） 中，e0/b0=2.15，20 d 后 e1/b1=2，40 d 后 e2/b2=1.98。代入公式（1），可得水解率φ1=7.0%，φ2=7.9%。酸性条件下水解结果表明：酯在酸性条件下稳定性较好，存在微弱水解且水解缓慢，40 d后水解率达7.9%。

图4 PDMAPS在酸性条件下第20，40 d时的水解情况

（2） 中性条件下的水解

图5反映了中性条件下PDMAPS在第20，40 d时的水解情况。在初始PDMAPS核磁共振谱图中，e0/b0=2.00，20 d 后 e1/b1=1.99，40 d后 e2/b2=1.94。代入公式（1），可得水解率φ1=0.5%，φ2=3%。中性条件下的水解结果表明：酯在中性条件下稳定性较好，几乎不怎么水解，水解缓慢，40 d后水解率仅仅达到3%。

（3） 碱性条件下的水解

图6反映了碱性条件下PDMAPS在第20，40 d时的水解情况。在初始PDMAPS核磁共振谱图中，e0/b0=2.35，20 d 后 e1/b1=1.66，40 d 后 e2/b2=1.04。代入公式（1），可得水解率 φ1=29.4%，φ2=55.7%。碱性条件下的水解结果表明：酯键容易在碱性条件下水解，20 d后达到29.4%，40 d后达到55.7%。

为清楚地表示PDMAPS在不同pH下的水解情况，将核磁结果处理成水解率数据，具体见表1。

图5 PDMAPS在中性条件下第20,40 d时的水解情况

图6 PDMAPS在碱性条件下第20,40 d时的水解情况

表1 PDMAPS在不同pH条件下的水解率%

2.2.2 PDMMPPS在不同pH条件下的水解结果

（1） 酸性条件下的水解

图7反映了酸性条件下PDMMPPS在第20，40 d时的水解情况。初始PDMMPPS核磁共振谱图（见图 3） 中，f0/b0=2.22，20 d 后 f1/b1=1.99，40 d 后 f2/b2=1.81。代入公式（1），可得水解率φ1=10.3%%，φ2=18.5%。酸性水解结果表明酰胺键在酸性条件下比较容易水解，40 d后水解率能够达到18.5%。

图7 PDMMPPS在酸性条件下第20天、40天的水解

（2） 中性条件下的水解

图8反映了中性条件下PDMMPPS在第20，40 d时的水解情况。初始PDMMPPS核磁共振谱图中，f0/b0=2.07，20 d后 f1/b1=2.06，40 d后 f2/b2=2.04。代入公式（1），可得水解率φ1=0.5%，φ2=1.4%。中性水解结果表明：酰胺键在中性条件下几乎不水解，40 d后水解率仅约为1.4%。

（3） 碱性条件下的水解

图9反映了碱性条件下PDMMPPS在第20，40 d时的水解情况。初始PDMMPPS核磁共振谱图中，f0/b0=2.14，20 d后 f1/b1=2.14，40 d后 f2/b2=2.14。代入公式（1），可得水解率 φ1=0，φ2=0。碱性水解结果表明酰胺键在碱性条件下不水解，40 d后聚合物核磁没有变化。

为清楚地表示PDMMPPS在不同pH条件下的水解情况，将核磁结果处理成水解率数据，见表2。

2.2.3 PDMAPS的常温透析水解

2.2.3.1 PDMAPS的常温透析水解核磁分析

为了进一步研究PDMAPS的水解情况和机理，在常温条件下不断地换水，除去水解产生的小分子基团，观察进一步的核磁结果。从透析水解前后的核磁对比图可以看出，e/b的值逐渐减小，意味着聚合物存在缓慢水解。表3列出了e/b值以及水解率，初始e/b值为2.23。

图8 PDMMPPS在中性条件下第20,40 d时的水解情况

图9 PDMMPPS在碱性条件下第20,40 d时的水解情况

表2 PDMMPPS在不同pH条件下的水解率数据%

从表3可以看出随着小分子基团的除去，水解缓慢进行，说明PDMAPS中的酯键也存在一定的水解平衡，当除去水解产物时，平衡被打破，水解反应正向进行，虽然水解较为缓慢，但100 d左右能够高达21.5%。

表3 PDMAPS在常温条件下透析水解数据

2.2.3.2 PDMAPS常温透析水解XPS测试

为了进一步验证水解结果的可靠性，将透析水解96 d后的样品与未做水解的样品进行XPS测试，结果如图10所示。

图10 PDMAPS透析水解前后XPS对比图

从图10可以看出，C，N，O，S 4种元素的峰均有一定的削弱。这说明聚合物发生了变化，使得支链元素减少，由此推断聚合物发生了水解。4种元素的组成见表4。

表4 PDMAPS透析水解前后的元素组成%

根据公式（2）：按照 x(C)/x(N)值计算得出 t=0.916，水解率φ=21.8%；根据x(C)/x(S)值计算得出t=0.913，水解率φ=20.8%。上述结果均很接近核磁分析的结果（φ=21.5%），说明了数据的可靠性。

2.2.4 PDMAPS和PDMMPPS在高温条件下的水解

为了进一步研究PDMAPS酯键和PDMMPPS酰胺键的稳定性，分别将制备好的PDMAPS和PDMMPPS置于80℃、0.1 mol/L的NaCl溶液中冷凝回流3 d，然后除杂透析，冷冻干燥后送核磁分析。图11和图12分别表示了PDMAPS和

PDMMPPS水解前后的核磁对照，结果表明：酰胺键的热稳定性强于酯键；根据e0/b0=2.03，e1/b1=1.45，推算出PDMAPS的酯键水解率φ=28.6%；根据f0/b0=2.11，f1/b1=2.03，推算出PDMMPPS的酰胺键水解率φ=3.8%。

图11 PDMAPS在80℃下水解前后的核磁对照

图12 PDMMPPS在80℃下水解前后的核磁对照

2.3 PDMAPS在常温条件下透析水解前后的抗菌性能对比

核磁和XPS结果均显示PDMAPS在常温条件下透析存在缓慢水解，为了验证缓慢的部分水解对其抗菌性能的影响，分别取0，12，96 d时的水解样品做抗菌实验，结果如图13和图14所示。

结果表明常温透析时间越长，抗菌效果越差。随着时间的延长，水解缓慢进行，而抗菌效果变差，说明聚合物中起抗菌效果的基团主要为季铵磺酸盐，即两性离子基团，因而随着水解所致的两性离子基团的脱落，抗菌效果逐渐减弱。

图13 透析0 d(a),12 d(b),96 d(c)时PDMAPS的抗菌效果，(d)为空白对照

3 结论

PDMAPS和PDMMPPS 2种两性离子聚合物分别含有酯键和酰胺键。本研究表明：酯键对碱敏感，在酸中存在一定的水解，而在常温中性溶液中较为稳定。在常温透析水解过程中，通过不断地除去水解产生的小分子，能够促进水解缓慢进行，虽然水解速率较慢，但在100 d时水解率也可以达到21%左右。这说明酯键的水解是一个平衡反应，当除去水解产物小分子时，平衡正向进行；同时解释了为什么酯键对碱更为敏感，因为部分水解的聚合物产生的羧基容易结合OH-，从而阻碍了逆向反应的进行。而酰胺键则恰恰相反，对酸更为敏感，在中性乃至碱性条件下几乎不水解。80℃下的水解结果说明，酰胺键通常较为稳定，在高温条件下水解趋势也不是很明显，相比之下，酯键的稳定性要差很多。

透析水解的XPS结果是对核磁结果的一个有力佐证，进一步说明了PDMAPS在NaCl溶液中存在缓慢水解。抗菌实验结果直观地反映了水解之后，随着酯键的断裂，两性离子基团脱落，聚合物抗菌能力下降。

图14 PDMAPS常温透析水解前后的抗菌条形图