裙带菜酶解物抗焦虑作用

颜 泽,姜燕蓉,熊笑妍,刘 畅,胡建恩,卢 航,赵 慧

(大连海洋大学食品科学与工程学院,辽宁大连 116023)

焦虑是针对环境变化所产生的一种应激行为,随着生活节奏的加快,人们承受的压力日益沉重,焦虑情绪严重影响人们正常的生活和工作[1-2]。越来越多的抗焦虑药物如苯二氮卓类(benzodiazepines)被应用到焦虑症的治疗之中,这些药物虽然见效快，但同时也存在诸多副作用[3]。食源性天然活性物质具有安全、无毒、副作用小、易吸收等特点,很大程度上可以避免合成类药物的毒副作用。目前食源性抗焦虑活性的研究主要集中在肽、多酚和多糖类等物质,许多学者进行了初步的探索。如Zhao等从菠菜中分离得到具有抗焦虑效果的肽[4];Cho等研究发现腔昆布(Eckloniacava)多酚提取物具有抗焦虑活性[3];Monteiro等在红藻(Gracilariacornea)多糖的抗焦虑作用研究中,发现其作用机制可能与γ-氨基丁酸能系统(GABAergic system)有关[5]。以上研究成果说明食源性天然活性物质具有开发抗焦虑保健食品或药品的潜力,但是具体的作用机理仍需要进一步探讨。

裙带菜(Undariapinnatifida)是我国主要的养殖经济藻类之一,广泛分布于我国辽宁、山东、江苏、浙江等沿海城市,具有食用和药用价值,享有“海洋蔬菜”的美称[6]。目前对于裙带菜生物活性成分的研究主要集中在多糖、肽类以及岩藻黄素等,发现其具有降血脂、降血压、降胆固醇、抗凝血等多种生理活性[7-10],但是在神经作用尤其是抗焦虑活性方面的研究较少。

本研究通过蛋白酶酶解裙带菜,考察其酶解物对ICR小鼠在高架十字迷宫(elevated plus maze,EPM)实验中的行为影响,以及长期灌胃后对小鼠脑组织中神经内分泌物多巴胺(dopamine,DA)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量的影响,初步探讨裙带菜酶解物的抗焦虑作用,为开发经济型海洋抗焦虑活性物质提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

裙带菜 当地海鲜市场(辽宁,大连);安定(diazepam) 纯度≥99.0%,日本和光纯药工业株式会社;胃蛋白酶(800～2500 U/mg) 美国Sigma公司;磷酸(PBS)缓冲液 生工生物工程(上海)股份有限公司;DA ELISA试剂检测盒、5-HT ELISA试剂检测盒 南京建成生物工程研究所;SPF级雄性ICR小鼠50只,体重(24±2)g,动物及饲料 大连医科大学SPF动物实验中心。

BS-224S分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司;XM-800Y高速粉碎机 广州市旭朗粉碎机机械设备有限公司;SYG-2型恒温水浴锅 常州朗越仪器制造有限公司;JJ-1型磁力搅拌器 常州国华电器有限公司;PHS-25型pH计 上海雷磁仪器有限公司;MD10透析袋(MWCO=6 kDa) 美国联合碳化物公司;H-1850R离心机 湘仪离心机仪器有限公司;SCIENTZ-10ND型冻干机 宁波新芝生物科技股份有限公司;玻璃匀浆器 上海雷布斯网络科技有限公司;SYNERGY H1酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;高架十字迷宫 上海软隆科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 海藻酶解物的制备 新鲜裙带菜干燥(65 ℃,48 h),高速粉碎机粉碎,与蒸馏水以1∶30 (w/v)混合搅拌,1 mol/L NaOH溶液调节pH至11,3 h后用1 mol/L HCl溶液调节pH至2,加入胃蛋白酶(酶与裙带菜干粉比1∶20 (w/w)),37 ℃酶解24 h,100 ℃水浴下灭酶10 min,4 ℃、9000 r/min条件下离心30 min,取上清液即裙带菜酶解液(wakame hydrolysate,WH,留取部分备用),于6 kDa透析袋中用蒸馏水透析3次,每次24 h,最后合并3次透析滤过液(wakame hydrolysate A,WH-A),同时取出透析残留液(wakame hydrolysate B,WH-B),分别冷冻干燥后称重备用。

1.2.2 实验动物及分组 小鼠置于相对湿度40%～70%,温度(22±2) ℃的12/12 h光暗循环的动物饲养室,自由进食标准鼠粮及饮水。实验采用健康雄性ICR小鼠50只,随机分成5组:空白对照(生理盐水);Diazepam组2 mg/kg;WH组1 g/kg;WH-A组1 g/kg;WH-B组1 g/kg,腹腔注射后进行行为学实验。行为学实验完成后继续按原组别:空白对照组(去离子水);Diazepam组0.3 mg/kg;WH组0.3 mg/kg;WH-A组0.3 mg/kg;WH-B组0.3 mg/kg,进行灌胃,每日灌胃1次,每次0.3 ml,连续灌胃28 d。

1.2.3 EPM实验 EPM是检测小鼠焦虑行为的常用方法,利用小鼠对新事物的好奇心理与嗜暗天性之间的探究与回避的冲突行为,通过小鼠在开臂与闭臂内的滞留时间和路径来评价小鼠的焦虑行为[11]。

实验参考Zhao等[4]方法,略作调整。提前3 h将小鼠转移至行为学实验室,以适应环境。实验前清洁EPM装置。小鼠按照不同组别(空白对照组、Diazepam组、WH组、WH-A组、WH-B组)腹腔注射相应物质30 min后,将小鼠放置于EPM装置开臂与闭臂接合处,小鼠面朝开臂,分别记录5 min内小鼠进入开臂的次数(open arm entry,OE)和闭臂的次数(closed arm entry,CE)、在开臂滞留的时间(open arm time,OT)和闭臂滞留的时间(closed arm time,CT)、进入开臂与闭臂的总次数(total entry,TE)。分别计算小鼠在开臂中的滞留时间百分比(OT%),OT%=OT/(OT+CT)×100;开臂进入次数百分比(OE%),OE%=OE/(OE+CE)×100;各臂总进入次数(TE),TE=OE+CE。实验过程中以小鼠四爪全部进入为进臂标准。每次实验结束后将小鼠放回鼠笼,用70%乙醇将EPM装置擦拭干净,并用纸巾擦干。

1.2.4 DA与5-HT含量测定 灌胃28 d后,将小鼠断头取脑,用预冷的PBS溶液(pH7.4)清洗表面血迹,用滤纸吸干水分,称重后放入组织研磨器,并加入PBS溶液在冰浴中将脑组织充分匀浆,匀浆后离心(5000 r/min,10 min,4 ℃)取上清液,立即分装并放置于-80 ℃冰箱保存备用。采用ELISA法检测小鼠组织匀浆液中DA和5-HT含量,具体操作方法参照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理

所有结果都用平均值±标准误表示,用变异数分析(one way analysis of variance,one way ANOVA)来评估各组间的差异，p<0.05为统计显著性水平。

2 结果与分析

2.1 EPM实验

2.1.1 滞留时间的变化 图1所示为ICR小鼠的OT%。与空白对照组(20.4%±2.8%)相比,WH组和WH-B组的OT%无显著性差异(p>0.05),而WH-A组小鼠的OT%极显著(p<0.01)增加,与Diazepam组(p<0.05)具有相同趋势的作用效果;与Diazepam组(41.4%±8.4%)相比,WH-A组、WH-B组和WH组均无显著性差异(p>0.05)。Ota等[12]的研究表明具有抗焦虑效果的大豆来源十一肽FLSSTEAQQSY显著(p<0.05)增加了小鼠的OT%,与本实验结果相似,说明WH-A组OT%的增加与抗焦虑作用有关。因此推断裙带菜酶解液通过透析处理后,分子量小于6 kDa的组分中可能含有抗焦虑活性成分。

2.1.2 进入次数的变化 图2所示为ICR小鼠OE%。与空白对照组(31.0%±4.4%)相比,WH组(45.2%±5.7%)在开臂中OE%虽有增加的趋势,但是并未产生显著性影响(p>0.05)。经过透析处理之后,与空白对照组相比,WH-A组小鼠的OE%极显著(p<0.01)的增加,WH组和WH-B组小鼠的OE%无显著差异(p>0.05)。与Diazepam组相比,WH-A组和WH组的OE%未见显著性差异(p>0.05),但是WH-B组小鼠的OE%出现了极显著(p<0.01)的减小。Kanegawa等[13]发现抗焦虑肽在小鼠的EPM实验中显著增加OT%的同时OE%也会显著增加(p<0.05),此结果与本实验结果中WH-A组相似,因此可以判断WH-A组中含有抗焦虑活性成分。因此,能引起小鼠OE%增加的有效成分集中在分子量范围在6 kDa以下的组分中,即裙带菜酶解物具有抗焦虑活性的决定性组分。

图2 各组小鼠在EPM实验中开臂进入次数百分比(n=10)Fig.2 OE% of different mice groups in EPM test(n=10)

2.1.3 总行动量的变化 小鼠在EPM实验中的TE反映小鼠的活跃程度[14]。裙带菜酶解物各组与空白对照组(18.1%±1.5%)相比均有TE减少的趋势(图3),其中WH组和WH-B组的TE均极显著(p<0.01)减小;与Diazepam组相比,WH-A组的TE显著(p<0.05)减少,WH组与WH-B组的TE均极显著(p<0.01)减少。结果表明,裙带菜酶解物中分子量大于6 kDa的组分中含有影响小鼠行动量的成分,而分子量小于6 kDa的组分对行动量的影响较小。根据Cho等研究结果,海藻中含有催眠作用的成分[15],而与抗焦虑作用相关联的受体,如5-HT、DA和GABA等同时也是促睡眠或镇静的作用受体[15-17],由此推测裙带菜酶解物各组中可能含有具有催眠作用的成分,从而影响了小鼠的活跃程度。

图3 各组小鼠在EPM实验中总行动量的变化(n=10)Fig.3 Changes of TE of different mice groups in EPM test(n=10)

本研究以海洋植物为研究对象,通过EPM实验结果,发现裙带菜酶解物WH-A即分子量小于6 kDa的组分对ICR小鼠具有抗焦虑效果,并且对其行动量不产生显著性影响(p>0.05)。但是WH-A的具体组成成分,以及产生抗焦虑活性有效成分的结构和特性仍需进一步深入研究。

2.2 裙带菜酶解物对小鼠脑组织中DA和5-HT含量的影响

2.2.1 裙带菜酶解物对DA含量的影响 DA作为与焦虑相关联的神经递质之一,其含量的变化会引起情绪的紧张或放松,因此在对焦虑的研究中常作为检测指标进行分析[18-19]。图4为28 d连续灌胃后,各组小鼠脑组织中DA含量的变化情况。结果显示,与空白组相比,仅Diazepam组DA含量显著(p<0.05)降低,此结果与Hegarty等研究结果相似,可能是GABA体系参与了DA分泌体系的活动[20]。与空白组相比,裙带菜酶解物各组中DA含量均无显著差别(p>0.05),说明裙带菜酶解物可能与DA体系无关联性;也可能是酶解物通过消化系统代谢后,未能跨越血脑屏障而对脑组织中DA体系产生影响,因此没有改变脑组织中DA的分泌量。裙带菜酶解物对脑组织中DA体系的直接作用仍需进一步探讨。

2.2.2 裙带菜酶解物对5-HT含量的影响 5-HT作为神经递质,主要分布于脑的松果体和下丘脑,其水平的异常会引起精神类疾病的产生,与抑郁症、焦虑症的发病机制密切相关,抗焦虑药物如氟西汀、帕罗西汀等就是通过抑制5-HT的再摄取,降低5-HT浓度,从而起到抗焦虑作用,达到治疗目的[21-23]。长期投喂裙带菜酶解物后,小鼠脑组织中5-HT含量的变化如图5所示,与空白组相比,Diazepam组的5-HT含量极显著(p<0.01)减少,可能是GABA体系对5-HT的合成起到了抑制的作用[24]。同时,与空白组相比,WH-A组的5-HT含量也发生了显著(p<0.05)降低,但是WH与WH-B组并没有显著变化(p>0.05),说明裙带菜酶解物中分子量小于6 kDa的组分经消化系统代谢后,能够直接或间接的作用于5-HT关联受体,抑制小鼠脑组织中5-HT的分泌,产生抗焦虑的作用效果。

图5 各组小鼠脑组织中5-HT含量的变化(n=10)Fig.5 Changes of 5-HT levels in brain tissue of different mice groups(n=10)

3 结论

本研究通过EPM实验证实了裙带菜酶解物WH-A,即分子量小于6 kDa的组分具有抗焦虑活性,其对小鼠脑组织中DA含量未产生显著性影响(p>0.05),但是降低了小鼠脑组织中5-HT的含量从而改善了小鼠的焦虑程度,因此裙带菜酶解物的抗焦虑作用机理与5-HT受体相关联。本研究为裙带菜中活性成分的研究提供了理论依据,并为海洋生物资源的高值化利用提供了思路。