不同提取方法对酸枣仁油成分与品质的影响

陶 冶,程 铭,焦文佳,夏廉臣,王雪晖,王春维,祝爱侠

(武汉轻工大学,湖北武汉 430023)

酸枣仁为鼠李科植物酸枣(ZiziphusjujubaMill.vat.spinosa(Bunge)Hu ex H.E Chou)干燥成熟的种子,作为一种药食同源的传统中草药,主要含有脂肪酸、黄酮类、生物碱、氨基酸、三萜类等生物活性成分。酸枣仁始载于《神农本草经》,其性平味甘、酸,归肝、胆经。《本草纲目》、《金匮要略》等中医药典中均有记载,对人体安全、无毒、无副作用。酸枣仁不论生用、熟用都有安神催眠作用,而且在炮制中“久炒油枯而疗效降低”[1],说明酸枣仁油在疗效中起着重要作用。研究发现,酸枣仁中油脂含量高达32%[2]。酸枣仁油中主要由六种脂肪酸组成,其中不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸和花生烯酸等约占总量的90%,具有很高的营养价值,同时也具有抗氧化、防治动脉硬化、降血脂、提高免疫力等药理作用[3-6]。

目前,提取酸枣仁油的方法主要有微波辅助提取法、超声辅助提取法、超临界CO2萃取法等,不同提取方法对酸枣仁油得率及脂肪酸组成影响的研究尚未见报道。本文着重考察亚临界丁烷萃取法、超声提取法和索氏抽提法对酸枣仁油得率的影响,GC-MS法分析三种不同方法得到的酸枣仁油脂肪酸组成和含量,比较了三种不同方法提取油脂中抗氧化活性物质VE的含量以及氧化稳定性,以期为酸枣仁油的工业化生产和质量控制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸枣仁 市购(原产地河南);甲醇、正己烷均为高效液相色谱级 购于天津市科密欧化学试剂有限公司;丁烷 纯度大于95% 河南河阳石化有限公司。

CBE-5L型亚临界流体萃取设备 河南省亚临界生物技术有限公司;7890/5975I气质联用仪 美国Agilent公司;毛细管色谱柱HP-FFAP美国Agilent公司;离心机(TGL205) 长沙平凡仪器仪表有限公司;涡旋混合器(S25) 德国IKA公司;YB-1000A型植物粉碎机 大连运邦科技发展有限公司;PCWJ-10型超纯水机 成都品成科技有限公司;Agilent 1260 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 酸枣仁置于40 ℃烘箱中干燥5 h,粉碎,过80目筛,取筛下物至阴凉、干燥处保存。

1.2.2 酸枣仁油的提取

1.2.2.1 亚临界丁烷萃取法 称取500 g酸枣仁粉,装入萃取袋后放入萃取罐中。实验中,先将系统抽成真空状态,真空度为0.1 MPa左右。萃取溶剂为丁烷,在实验设定的萃取条件下进行亚临界萃取,萃取的过程中通过运用循环热水,对萃取罐进行加热,加热温度为45 ℃,萃取时间设定40 min,萃取结束后,将含有脂溶性成分的亚临界流体从萃取罐中放出,进入脱溶罐进行减压蒸发,待溶剂脱除完毕,便可放出酸枣仁油,离心除杂,即为所需酸枣仁油[7]。计算得率如式(1)，萃取工艺路线见图1。

图1 亚临界流体萃取装置及工艺流程图Fig.1 Subcritical extraction equipments and process chart

1.2.2.2 索氏抽提法 称取5.0 g的酸枣仁粉末,置于滤纸筒,再将纸筒平缓的放入索氏提取筒内,加200 mL石油醚溶液,使纸筒完全浸没于石油醚中。在80 ℃回流提取7.0 h,至纸筒周围浸泡液基本呈无色,将提取液减压抽滤后,旋转蒸发,称提取物重量[8],按式(1)计算得率。

1.2.2.3 超声辅助提取法 称取约20.0 g的酸枣仁粉末,置于100 mL锥形瓶中,用50 mL石油醚溶液在50 ℃超声提取1.0 h,将提取液减压抽滤后,旋转蒸发,称提取物重量[4],按式(1)计算得率。

1.2.3 测定方法

1.2.3.1 酸枣仁油得率的计算方法

式(1)

式(1)中:M为酸枣仁的质量,g;M1为空瓶的质量,g;M2为空瓶和酸枣仁油的质量,g。

1.2.3.2 酸枣仁油主要理化指标测定 酸价是脂肪中游离脂肪酸含量的标志,油脂在制取或贮藏过程中受热或在解脂酶的作用下分解产生游离脂肪酸,从而使油中酸价增加,游离脂肪酸的含量与油脂的品质有关,因此酸价常作为衡量油脂品质的重要指标之一[9]。酸枣仁油酸价的测定:参照GB/T 5530-2005动植物油脂酸值和酸度的测定。过氧化值反映的是油脂氧化酸败的程度,酸败程度越小,过氧化值越低,说明油脂质量越好[10]。酸枣仁油过氧化值的测定:参照GB/T 5538-2005动植物油脂过氧化值的测定。皂化值的高低表示油脂中脂肪酸分子量的大小,含有游离脂肪酸将使皂化值升高,皂化值在一定程度上也可以反映油脂的纯度[11]。酸枣仁油皂化值的测定:参照GB/T 5534-2008动植物油脂皂化值的测定。碘值是表示油脂不饱和程度的指标,不饱和程度越大,碘值越高。酸枣仁油碘值的测定:参照GB/T 5532-2008动植物油脂碘值的测定。

1.2.3.3 酸枣仁油脂肪酸组成测定 取酸枣仁油50 mg,置于10 mL离心管,加2 mL正己烷溶解,再加2 mL 0.4 mol/L氢氧化钾甲醇溶液,振荡,摇匀,静置30 min,取上层有机相,过膜,待做GC-MS分析[12-15]。

色谱柱HP-FFAP(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱,升温程序:140 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至190 ℃,再以2 ℃/min升至220 ℃,保持14 min。载气为高纯He,流速为1.0 mL/min,进样量为1 μL,分流比为10∶1,进样口温度230 ℃,压力为12.775 psi,检测器温度240 ℃。

质谱条件:EI离子源;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃,四级杆150 ℃;溶剂延迟14 min,扫描范围50～500。

根据标准品的色谱峰保留时间、质谱信息,同时结合质谱数据库检索结果,参考相关文献,对植物油中脂肪酸成分进行分析,应用峰面积归一化法对其进行定性定量分析,用Microsoft Excel 对各组数据进行计算分析。

1.2.3.4 酸枣仁油中VE含量的测定 参照NY/T 1598-2008标准,制备样品溶液,采用高效液相色谱法对酸枣仁油中维生素E的含量和组成进行色谱分析,根据不同维生素E标样的保留时间确定酸枣仁油中维生素E不同异构体,根据维生素E进样量与峰面积成正比关系,算出酸枣仁油中维生素E总含量[16]。

色谱条件:色谱柱:phenomenex色谱柱(250 mm×4.60 mm,5 μm);流动相:100%甲醇;流速:1 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:40 μL;检测波长:300 nm;保留时间:20 min。

1.2.3.5 不同方法提取酸枣仁油的自氧化实验 采用Schaal烘箱法将亚临界丁烷萃取法、索氏抽提法和超声辅助提取法提取的酸枣仁油分别置于(60±1) ℃的恒温烘箱中,每隔 2 d取油样分析,测定其过氧化值(POV),比较不同方法提取的酸枣仁油的变化情况。过氧化值的测定方法参照GB/T 5538-2005标准[17]。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0数据统计软件和Origin 9.0软件对有关实验数据做相应的数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对酸枣仁油得率的影响

不同提取方法对酸枣仁油得率的影响结果如表1所示。由表1可见,索氏抽提法得率(28.02%)和亚临界萃取法得率(26.76%)显著高于超声提取法(24.45%)(p<0.05),亚临界丁烷萃取法得率(26.76%)较索氏抽提法得率(28.02%)有一定降低,但差异不显著。索氏抽提法所需能耗较低,但耗时最长,为亚临界萃取法的11倍,且提取温度较高,不利于酸枣仁油中脂肪酸的保存,进而会导致酸枣仁油发生氧化;超声提取虽时间短且温度低,所需能耗也较低,但得率较低;亚临界丁烷萃取法相比之下耗能较高,但可以在较低温度下溶出更多目标物,且反应时间大大缩短,有效提高了生产效率,故选择亚临界丁烷提取法效果为最佳,这与文献采用亚临界萃取澳洲坚果油结论一致[15]。

表1 不同提取方法所得酸枣仁油得率Table 1 Yield of jujube seed oil by different extraction methods

2.2 不同提取方法对酸枣仁油理化指标的影响

从表2可以看出亚临界丁烷萃取法油脂的酸价、过氧化值最低,索氏抽提法油脂的酸价、过氧化值最高。原因可能是由于索氏抽提工艺温度较高,持续时间较长,导致油脂氧化程度高,而采用亚临界丁烷萃取法在整个萃取和分离过程中都在低温下进行,能很好地保留提取物中的活性成分,因此亚临界萃取法提取的油脂品质较好[18]。比较三种不同方法提取酸枣仁油脂的皂化值,可以看出亚临界丁烷提取法提取的油脂的皂化值最高,表明其纯度最高。三种不同方法提取的酸枣仁油脂的皂化值在185～187 mg/g之间,与文献报道一致[19]。三种不同方法提取的酸枣仁油的碘值的大小依次为:亚临界丁烷萃取法>超声辅助提取法>索氏抽提法,说明采用亚临界丁烷萃取的酸枣仁油脂中不饱和脂肪酸含量最高。

表2 三种不同方法提取酸枣仁油脂理化性质Table 2 Physicochemical properties of jujube seed oil by three kinds of different methods

2.3 不同提取方法对酸枣仁油脂肪酸组成的影响

对三种不同方法所得酸枣仁油脂肪酸甲酯进行GC-MS分析,得到总离子流图见图2～图4。通过质谱信息与质谱库对照,测得了三种方法提取的酸枣仁油中脂肪酸组成及相对含量,结果见表3。

图2 亚临界丁烷萃取所得酸枣仁油脂肪酸甲酯GC/MS分析总离子流色谱图Fig.2 GC/MS analysis total ion chromatogram of fatty acid methyl ester in jujube seed oil obtained from subcritical butane extraction

图3 索氏抽提所得酸枣仁油脂肪酸甲酯GC/MS分析总离子流色谱图Fig.3 GC/MS analysis total ion chromatogram of fatty acid methyl ester in jujube seed oil obtained from soxhlet extraction

图4 超声辅助提取所得酸枣仁油脂肪酸甲酯GC/MS分析总离子流色谱图Fig.4 GC/MS analysis total ion chromatogram of fatty acid methyl ester in seed kernel oil obtained from ultrasonic-assisted extraction

表3 不同提取方法所得酸枣仁油脂肪酸组成与相对含量Table 3 Composition and relative content of the fatty acids in jujube kernel oil obtained from different extraction methods

由表3可知,通过GC-MS 分析,亚临界丁烷萃取法、超声波辅助提取法、索氏抽提法所得酸枣仁油共被鉴定出15种脂肪酸成分,三种提取方法所得油脂不饱和脂肪酸中均含有油酸、亚油酸、亚麻酸、花生酸、二十二烷酸和饱和脂肪酸棕榈酸。亚临界丁烷萃取法得到的酸枣仁油脂肪酸组成与后两种有较大的差异,具体表现在亚临界丁烷萃取法所得酸枣仁油含有少量的棕榈酸,并检测出十七烯酸、硬脂酸和二十碳二烯酸;其单不饱和脂肪酸含量为45.13%,不饱和脂肪酸总量为74.12%,明显高于其它两种方法,与前述碘值检测结果相对应。索氏抽提法和超声辅助提取法所得酸枣仁油脂肪酸组成有4种明显不同,具体表现在索氏抽提法相对于超声辅助提取法所得酸枣仁油能检测出十五烷酸和二十四烷酸,超声辅助提取法相对于索氏抽提法所得酸枣仁油能检测出十六碳烯酸和二十碳五烯酸。因此,从脂肪酸组成与相对含量两个主要指标分析,亚临界丁烷萃取法可萃取出品质较高的酸枣仁油。酸枣仁油的碳链长度在C14～C24之间,是一种以油酸和亚油酸为主的不饱和脂肪酸油脂,其不饱和脂肪酸含量高达69%～74%;油酸含量约为42%,亚油酸含量约为31%[20]。油酸和亚油酸含量是评价植物油品质的一个重要营养指标,其在人体的脂质代谢中发挥着重要作用。通常在营养学界油酸被称为“安全脂肪酸”,可以供给人体所需的大量热能,同时也可有效预防冠心病等心脑血管疾病的发生[21]。亚油酸是一种人体必需脂肪酸,具有“血管清道夫”的美誉,能降低血液胆固醇,预防动脉粥样硬化[22]。因此,酸枣仁油具有很高的营养价值。

2.4 不同提取方法对酸枣仁油中VE含量的影响

称取不同提取方法得到的酸枣仁油若干克,稀释后进行高效液相色谱分析。所得酸枣仁油VE含量的高效液相色谱图和VE标准品图见图5。

图5 不同提取方法所得VE高效液相色谱图Fig.5 VE high performance liquid chromatogrophy(HPLC)obtained by different extraction methods

VE是生育酚的混合物,主要存在于植物油脂中,作为脂溶性维生素之一是一种重要的生理抗氧化剂。根据不同提取方法所得酸枣仁油中VE的出峰时间对比VE标品出峰时间,确定酸枣仁油中VE的主要成分为γ-VE,所以以γ-VE替代酸枣仁油中总VE含量。根据样品峰面积由标曲公式算出不同提取方法所得VE的含量,结果见表4。

表4 三种不同方法提取酸枣仁油中VE含量Table 4 VE content in jujube kernel oil extracted by three different methods

由表4可知,亚临界丁烷萃取法所得酸枣仁油中VE含量显著高于其他两种方法所得酸枣仁油中VE的含量(p<0.05),酸枣仁油中VE含量由大到小的顺序依次为:亚临界丁烷萃取法>索氏抽提法>超声提取法,主要是由于亚临界丁烷萃取时低温、无氧的条件降低了天然活性成分的破坏,较好的保存了酸枣仁油中的VE[23]。

2.5 不同方法提取酸枣仁油自氧化过程中过氧化值的变化

由图6可见,在强制氧化2 d后,三种方法提取的酸枣仁油的过氧化值没有明显差异。强制氧化4 d后,三种方法提取的酸枣仁油的过氧化值均有不同程度的增加,亚临界丁烷萃取法得到的酸枣仁油的过氧化值增长幅度较大,索氏抽提法及超声辅助提取法获得的酸枣仁油的过氧化值变化幅度小,后两种方法提取的酸枣仁油在强制氧化10 d后,过氧化值的上升幅度较小,亚临界萃取法得到的酸枣仁油过氧化值仍大幅度上升。强制氧化14 d后,亚临界萃取法获得的酸枣仁油氧化值达到5.739 mmol/kg,后两种方法提取的酸枣仁油过氧化值均小于3 mmol/kg。因此,不同提取方法所得酸枣仁油的在两周的强制氧化过程中体现出的抗氧化能力由强到弱依次为:索氏抽提法>超声辅助提取法>亚临界丁烷萃取法,究其原因是因为亚临界萃取法提取的酸枣仁油脂中不饱和脂肪酸含量较高、易于氧化所致。

图6 不同方法提取酸枣仁油自氧化过程中过氧化值的变化Fig.6 Changes of peroxide value during self-oxidation of jujube kernel oil extracted by different methods

3 结论与讨论

三种不同方法提取的酸枣仁油在得率、组成成分、理化性质和氧化稳定性等方面存在较大差异,其中采用索氏抽提法提取的酸枣仁油得率最高,超声提取法提取的酸枣仁油得率最低。不同的提取方法对油脂的质量指标如酸价、过氧化值、皂化值以及碘值等影响较大。由于索氏抽提法耗时长,所以提取的新鲜油脂中过氧化值大于其余两种方法。三种方法提取的脂肪酸中不饱和脂肪酸含量依次为:亚临界丁烷萃取法>超声辅助提取法>索氏抽提法。三种方法提取的酸枣仁油中抗氧化活性物质VE含量依次为:亚临界丁烷萃取法>索氏抽提法>超声提取法,主要是因为亚临界低温、无氧萃取时降低了天然活性成分的破坏,较好的保存了原料中的VE。三种方法提取的油脂的抗氧化稳定性依次为:索氏抽提法>超声提取法>亚临界丁烷萃取法;导致亚临界丁烷萃取法所得油脂的氧化稳定性差的原因,主要是由于亚临界提取法所得酸枣仁油中不饱和脂肪酸含量高,易于氧化酸败所致[24]。

酸枣仁的主要有效成分为酸枣仁油,而酸枣仁油不稳定,容易变性和失效,选择一种有效的提取方法使我们迫切需要解决的问题,本实验通过比较亚临界丁烷萃取法、索氏抽提法和超声辅助提取法,进一步体现了亚临界丁烷萃取法提油得率较高、产品质量好、提取质量好、提取速度快等特点。

通过比较3种不同提取方法对酸枣仁油的得率和理化性质的影响,发现亚临界丁烷萃取法提油得率较高,所提酸枣仁油不饱和脂肪酸最多,品质最高。

不同提取方法所得的酸枣仁油脂肪酸组成成分存在差异,但也有一些共同成分,实验通过比较3中不同提取方法所得的酸枣仁油成分,得出了它们之前各自的独有成分和共同成分及相对含量,为酸枣仁的鉴定和质量控制提供了一定依据。

在检测不同方法所得酸枣仁油的VE含量和自氧化过程,发现亚临界丁烷萃取法所得酸枣仁油中VE含量最高,索氏抽提法所得酸枣仁油抗氧化能力最强,说明亚临界丁烷萃取法能得到更好品质的酸枣仁油,但是索氏抽提法所得酸枣仁油在长时间贮藏过程中,能体现出更好的抗氧化能力。

综合评定:亚临界丁烷萃取法得到的酸枣仁油品质最好。