不同酵母菌在枸杞酒酿造过程中对类胡萝卜素降解的影响

赵 璐,刘建花,张惠玲,马奇虎

(1.宁夏大学农学院,宁夏银川 750000;2.宁夏大学农学院,宁夏微生物制造应用技术与安全控制重点实验室,宁夏银川 750000;3.百瑞源枸杞股份有限公司,宁夏银川 750000)

发酵型枸杞酒是以枸杞为原料,经过酵母发酵制成的一种保健果酒,能够较多地保留活性物质[1],产品营养价值高,具有保健功效。枸杞中富含类胡萝卜素,类胡萝卜素是一种很不稳定的物质,类胡萝卜素对温度、光照及酸性条件较敏感,食品原料中含有的类胡萝卜素在加工过程以及储藏过程中很多因素会导致其降解,类胡萝卜素降解后,能产生大量具有特殊香气的物质,如β-紫罗兰酮、假紫罗兰酮、异佛尔酮、二氢-β-紫罗兰酮和β-环柠檬醛等。类胡萝卜素含量及降解产物与食品品质之间存在正相关关系,一方面食品外观品质(如色泽)与类胡萝卜素成分含量直接相关;另一方面类胡萝卜素是食品香气成分的重要前体物质,对食品的香气量、香气品质和风味有直接作用。类胡萝卜素降解可产生降异戊二烯衍生物[2],对酒的香气有影响,C9～C15类的类胡萝卜素衍生物不仅具有特殊香味,还具有对人体有益的生物活性功能,如β-紫罗兰酮可抑制癌细胞、调控癌细胞的增殖,并具有降血脂等功能[3]。

枸杞酒在发酵过程中,会产生代谢产物,使枸杞中的类胡萝卜素处于一个不稳定的体系中,不同的酵母发酵产生的发酵体系不同,温度、酸度变化也不同,使得枸杞中的类胡萝卜素发生变化也不同[4],导致类胡萝卜素降解产物的种类和含量也不同,对酒的香气贡献也不同。在枸杞酒的酿造中,除了酿酒酵母参与发酵外,一些非酿酒酵母也在参与发酵,不但影响着枸杞酒的香气物质,还有可能影响类胡萝卜素的降解。酵母菌的代谢可以改变代谢环境。如pH、酒精度等。环境的改变可能会引起类胡萝卜素发生降解。

本研究选择了具有代表性的五株酵母菌(法国酿酒活性干酵母、安琪酿酒活性干酵母以及实验室分离得到的葡萄汁有孢汉生酵母(Hanseniasperauvarum),全美梅氏酵母(Metschnikowiaspp.)、枸杞酵母(Lyciumbararumyeast)分别发酵,研究不同酵母发酵枸杞酒过程中对类胡萝卜素降解的影响,为今后优化改进枸杞酒酿造工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

法国酿酒活性干酵母XR 法国诺盟生物科技公司;安琪酿酒活性干酵母 Angel中国;枸杞酵母 NXD15(SaccharomycescerevisiaeNXD15);2株非酿酒酵母:葡萄汁有孢汉生酵母(Hanseniasperauvarum)、全美梅氏酵母(Metschnikowiaspp.),由宁夏大学生物工程实验室从枸杞汁中筛选得到;枸杞鲜果 宁夏百瑞源枸杞发展有限公司;玉米黄素双棕榈酸酯(zeaxanthin dipalmitate)标准品 纯度≥98%,美国ChromaDex;β-胡萝卜素(β-carotene)标准品 纯度≥98%,成都曼思特生物科技有限公司;玉米黄素(zeaxanthin)标准品 纯度≥97%,,美国ChromaDex;酒石酸 ≥99.8%,杭州临安金龙化工有限公司;二氧化硫 ≥99.8%,河南千志商贸有限公司;果胶酶 2 U/mL,法国进口;YPDA培养基、无水乙醇、乙醇(色谱纯)、甲醇(色谱纯) 宁夏盛泰尔生物有限公司;液体培养基:硝酸钠3 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钾0.5 g/L、硫酸铁0.01 g/L、蔗糖30 g/L、YNB培养基6.7 g/L。调整pH为3.5,灭菌条件为121 ℃,15 min;营养培养基:同上述液体培养基配方、琼脂20 g/L;YPDA液体培养基:蛋白胨20 g/L、酵母抽提物10 g/L、葡萄糖2 g/L、0.2%腺嘌呤溶液15 ml/L。调整pH为3.5,灭菌条件为121 ℃,15 min;有色合成培养基:硝酸钠3 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钾0.5 g/L、硫酸铁0.01 g/L、YNB培养基6.7 g/L、类胡萝卜素标准品(分别为玉米黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素双棕榈酸酯)15 g/L。调整pH为3.5,灭菌条件为121 ℃,15 min,其中YNB培养基及类胡萝卜素标准品在灭菌后加入 实验室自制;其他试剂 均购自天津大茂化学试剂公司。

TU-1901型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;LDZX-40C型自动立式电热压力蒸汽灭菌器 北京恒奥德仪器仪表有限公司;PHS-2C型数显酸度计 杭州奥利龙仪器有限公司;手持式糖度计 上海淋誉公司;岛津Prominence LC-20A高效液相色谱仪 瑞盛(深圳)科技有限公司;RE-501型旋转蒸发仪 上海科升仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同酵母菌特性分析

1.2.1.1 菌种扩培与活化 枸杞酵母菌、非酿酒酵母扩培:斜面试管菌→10 mL液体培养基试管(25 ℃、24 h)→100 mL液体培养基三角瓶(25 ℃、24 h)→待用。

活性干酵母活化:将法国酿酒活性干酵母、安琪酿酒活性干酵母分别在10%的蔗糖水溶液中37 ℃下活化30 min。

1.2.1.2 耐受性实验 由于商业酿酒活性干酵母(法国酿酒活性干酵母、安琪酿酒活性干酵母)耐性高,所以只对枸杞酵母与非酿酒酵母(葡萄汁有孢汉生酵母、全美梅氏酵母)进行以下耐受实验。将扩培好的3株酵母菌活化液以2%的接种量分别接种于5 mL YPDA液体培养基中,设置培养基(其他变量一定)pH为3.5,SO2浓度为150 mg/L,调整不同乙醇体积分数(酒精度)(3%vol、6%vol、9%vol、12%vol、15%vol);设置培养基(其他变量一定)乙醇浓度为9%,SO2浓度为150 mg/L时,调整不同pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5);设置培养基(其他变量一定)pH为3.5,乙醇浓度为9%时,调整不同的SO2浓度(50、100、150、200、250 mg/L),以不添加任何物质的枸杞原汁作空白对照,在25 ℃条件下培养48 h,取样用紫外分光光度计测定吸光度[5-6]。在600 nm波长下,通过被测样液吸光度值大小衡量菌体生长密度。

1.2.1.3 5株酵母菌发酵性能实验 鲜枸杞→分选→打浆→调酸度、糖度→加亚硫酸→添加酵母→发酵→取样测定

操作要点:将枸杞破碎打浆,取少量枸杞浆将蔗糖溶解后加入枸杞浆中使糖度为20°,用柠檬酸将pH调至3.3～3.5,添加亚硫酸,使SO2的含量达到60 mg/L。加果胶酶(0.035 g/L)常温下酶解4 h,4 h之后取样测定枸杞汁中玉米黄素双棕榈酸酯、β-胡萝卜素、玉米黄素,作为发酵前的原始数据。

接种发酵:取以上预处理后的枸杞汁(带果肉)分别接种活化好的5种不同酵母菌,菌液浓度均为1×107(cfu/mL),在25 ℃下避光避氧发酵,每日测量5株菌种发酵液的吸光值、酒精度、温度以及pH,当残糖在4 g/L左右不再下降时,终止发酵。2株非酿酒酵母发酵力弱,不能彻底发酵完全,当糖度不再下降时为发酵终止时间,绘制5种不同酵母菌的生长曲线、发酵液酒精度、发酵液pH以及发酵液温度的变化图。

1.2.2 枸杞酒样品中类胡萝卜素的提取 分别取5种酵母发酵后的枸杞酒10 mL,加少量的丙酮(去掉残渣中的水分以有利于后续有机溶剂的提取),20 ℃温度下以4000 r/min的转速离心10 min收集上清液于分液漏斗。将料渣倒入100 mL烧杯中,加入0.01%的抗氧化剂二丁基羟基甲苯(BHT),用丙酮∶石油醚=1∶2 (V/V),磁力搅拌辅助提取,800 r/min,提取温度为30 ℃,反复提取至料渣无色,合并提取液于分液漏斗;然后分次加入少量蒸馏水洗去水溶性杂质,然后静置分层,放掉下层水层,含有类胡萝卜素的上层加入无水硫酸钠去水;然后把上层转移到圆底烧瓶中,继而在38 ℃下用旋转蒸发仪浓缩,再加入少量二氯甲烷溶解类胡萝卜素后用本实验所用流动相定容至10 mL棕色容量瓶,再转存到冻存瓶,-35 ℃超低温冰箱保存备用[7-8]。

1.2.3 枸杞酒样品中类胡萝卜素的测定 使用高效液相色谱法测定玉米黄素双棕榈酸酯、玉米黄素及β-胡萝卜素的含量。

色谱条件:紫外可见光检测器;等度洗脱,流动相使用甲醇∶正己烷∶二氯甲烷∶乙腈=15∶20∶20∶40 (V/V);流动相流速为1 mL/min,色谱柱温度为25 ℃;检测波长为450 nm[9-10]。

3种类胡萝卜素标准曲线的绘制:避光精密称取β-胡萝卜素、玉米黄素及玉米黄素双棕榈酸酯标准品各0.005 g,分别溶于3 mL的二氯甲烷中,待标准品完全溶解后,加入1 g吐温-80进行乳化。在避光条件下,待二氯甲烷完全挥发,即溶液不再分层时,用流动相定容至10 mL容量瓶,得标准品的储备液,4 ℃保存待用[11]。以不同进样量(β-胡萝卜素0.5、1、2、5、10 μL;玉米黄素0.5、1、2、5、10 μL;玉米黄素双棕榈酸酯5、10、20、30、40 μL)为X轴,峰面积为Y轴,建立线性回归方程,结果见表1所示。

表1 3种胡萝卜素回归方程Table 1 Regression equation of three kinds of carotene

枸杞酒样品中类胡萝卜素的测定:将1.2.2中提取得到的类胡萝卜素采用1.2.3的检测条件进行测定,得到各枸杞酒样的色谱图。根据各样品色谱图中与标准品色谱图对比出峰时间,并将峰面积代入标准曲线,计算出各样品中3种类胡萝卜素的含量。

1.2.4 5株酵母菌对3种类胡萝卜素降解能力的比较分析 在1.2.1.3的发酵过程中,每天分别取样测定5株酵母菌发酵液胡萝卜素玉米黄素双棕榈酸酯、玉米黄素及β-胡萝卜素的变化值,并绘制3种类胡萝卜素变化曲线图。

1.2.5 5种酵母菌对自身降解类胡萝卜素能力的判定 为了准确分析发酵时类胡萝卜素降解原因,对实验中所选择的5株酵母分别进行类胡萝卜素降解实验,取5株待试酵母活化后,分别接种以玉米黄素、玉米黄素双棕榈酸酯、β-胡萝卜素为唯一碳源的有色合成培养基中,各组分含量为10 mg/L,以不接种为空白对照。在接种量4%,25 ℃下避光培养50 h,观察酵母生长情况以及培养基颜色变化,判断5株酵母菌对类胡萝卜素的降解能力(若培养基褪色,则说明酵母菌自身存在能够降解3种类胡萝卜素的酶)。

1.3 数据处理

酵母菌性能测定过程中所有指标均平行测定三次,数据采用SPSS 21.0进行差异分析,结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 菌株的耐受性

枸杞酵母、葡萄汁有孢汉生酵母和全美梅氏酵母3种酵母在不同乙醇浓度、pH以及二氧化硫浓度下的耐受性实验结果如图1所示。

从图1a可看出,3种菌株中,枸杞酵母对乙醇的耐受性最强,当乙醇体积分数达到15%vol时,其菌株生长密度仍远优于其他两种非酿酒酵母菌(葡萄汁有孢汉生酵母、全美梅氏酵母)。而葡萄汁有孢汉生酵母、与全美梅氏酵母菌对耐乙醇的能力较弱,在3%vol～6%vol,这与枸杞酵母属于酿酒酵母菌有关。枸杞酵母属于酿酒酵母菌,酿酒酵母一般耐受酒精度最高能够达到16%vol～18%vol[12]。而葡萄汁有孢汉生酵母和全美梅氏酵母属于非酿酒酵母,其在枸杞酒发酵初期,即发酵液酒精度较低时,尚能够进行发酵,但当酒精度达到临界耐受值时,二者就会停止发酵[13-14]。

从图1b可看出,3种酵母菌的菌体密度对pH的变化均呈现先升高后降低的趋势。pH在3.0～3.5时,三种酵母菌的菌体密度均呈上升趋势,且在pH为3.5时,达到峰值,而后随之下降。因此,在枸杞酒发酵时,应将pH调至3.5左右,以便酵母菌能更好地繁殖代谢。

从图1c可看出,枸杞酵母对SO2的耐受性最强,而两种非酿酒酵母对SO2浓度升高极为敏感。当SO2浓度达到100 mg/L时,两种非酿酒酵母几乎完全抑制。

图1 3种菌株的耐受性Fig.1 Tolerance of 3 yeasts注:a.不同乙醇体积分数;b.不同pH;c.不同SO2浓度。

2.2 5株酵母发酵性能比较

5株酵母发酵枸杞汁的生长曲线、发酵液酒精度、发酵液温度以及发酵液pH变化曲线如图2所示。

图2 5株酵母发酵性能比较Fig.2 Five strains of yeast fermentation performance comparison注:a.酵母的生长曲线;b.酵母产乙醇曲线;c.酵母生长温度变化曲线;d.酵母生长pH变化曲线。

由图2a可以看出,两株非酿酒酵母(葡萄汁有孢汉生酵母、全美梅氏酵母)增殖很快,均在发酵第1 d进入了对数生长期,但持续性短,在第4 d终止发酵,而另外3株酿酒酵母(法国酿酒活性干酵母、安琪酿酒活性干酵母、枸杞酵母)虽比以上2种非酿酒酵母启动慢,但发酵持久。其中,法国酿酒活性干酵母发酵力最强,第3 d进入对数生长期,安琪酿酒活性干酵母与枸杞酵母均在第4 d进入对数生长期,发酵第10 d后,接近发酵终止时。由图2b可知,在发酵终止期(或接近),葡萄汁有孢汉生酵母与全美梅氏酵母发酵液酒精度分别为4.26%vol、3.72%vol(第4 d);法国酿酒活性干酵母、安琪酿酒活性干酵母和枸杞酵母发酵液酒精度分别为11.56%vol、10.17%vol和8.43%vol(第10 d)。由图2c～图2d可知,5株酵母菌在发酵对数生长期,pH下降与温度上升的幅度均较大,非酿酒酵母发酵时间短,相对变化值小。从整体看,发酵性能大小为法国酿酒活性干酵母>安琪酿酒活性干酵母>枸杞酒酵母>全美梅氏酵母>葡萄汁有孢汉生酵母。

2.3 5株酵母菌在枸杞酒发酵中对3种类胡萝卜素的影响

2.3.1 枸杞中3种类胡萝卜素的HPLC色谱图 由图3、图4(以法国酿酒活性干酵母为例)可以看出,该色谱条件对枸杞酒样品中β-胡萝卜素、玉米黄素及玉米黄素双棕榈酸酯的分离效果较好,β-胡萝卜素、玉米黄素、玉米黄素双棕榈酸酯标准品出峰时间分别为5.639、2.173、17.120 min,样品出峰时间分别为5.687、2.190、17.230 min,各组分在该检测条件下能达到完全分离,柱效较高,保留时间稳定。

图3 3种类胡萝卜素标准品混合色谱图Fig.3 Chromatogram of carotenoid standard mixture

图4 枸杞酒样品色谱图Fig.4 Chinese wolfberry wine sample chromatogram

2.3.2 5种酵母菌发酵枸杞酒对3种类胡萝卜素的影响 由图5可以看出,3种类胡萝卜素曲线均为下降趋势,2种非酿酒酵母比酿酒酵母启动早,降解的速度快但发酵时间短。3种酿酒酵母发酵持续长,降解曲线也持久,其中法国酿酒活性干酵母发酵力最强,对类胡萝卜素响最大。

图5 不同酵母菌发酵枸杞酒对3种类胡萝卜素的影响Fig.5 Effects of alcoholic fermentation by different yeasts on three carotenoids

刘亚等[15]发现发酵枸杞酒时,羧酸类化合物是影响类胡萝卜素降解的最主要因素,其次为醛酮类物质,影响最小的是酯类化合物及醇类物质。因此,发酵环境的变化是影响类胡萝卜素变化的重要因素。而环境变化大小,取决于酵母的发酵力。结合图2发酵性能可知,发酵性能最优的法国酿酒活性干酵母引起pH下降与温度上升幅度最大,引起发酵液体系环境变化最大,因此,其对3种类胡萝卜素降解的影响也最大。而非酿酒酵母由于发酵力弱,对乙醇的耐受力差,所以很快停止发酵[16],因此其对类胡萝卜素降解的影响相对较小。

在枸杞中,3种类胡萝卜素都不稳定,随着发酵时间延长,都因发酵液的变化以及氧和光照的作用,使3种类胡萝卜素结构中的碳碳双键(C=C)氧化断裂从而氧化降解[17]。其中类胡萝卜素含量最多的是玉米黄素双棕榈酸酯,变化也最大。由于酵母菌的发酵产生羧酸类物质,使发酵液处于酸性环境,玉米黄素双棕榈酸酯在酸性条件下不稳定[18],可以分解为玉米黄素和棕榈酸,因此,图1中玉米黄素含量变化曲线会有忽然增高现象,且尤以法国酿酒活性干酵母与安琪酿酒活性干酵母曲线变化突出。此外,玉米黄素结构中含羟基(-OH)会与代谢产物有机酸中的羰基(-COO-)发生化学反应生成酯类化合物,还可以和醛酮等化合物反应生成酯类[19],也会被氧化,生成醛、酮或羧酸类[20],因此,随后的测定值含量减少,曲线呈下降趋势。虽然β-胡萝卜素与代谢产物发生化学反应的相对小些[21],但其同样对光、氧、温度因素很敏感,容易发生氧化降解和异构化[22],β-胡萝卜素经光照辐射氧化也可以转化为玉米黄素、脱氢胡萝卜素等产物[23],因此,随着发酵时间延长,β-胡萝卜素在枸杞酒酿制过程中也呈下降趋势。

2.4 5株酵母菌自身对类胡萝卜素的降解结果

通过实验得出,5株酵母菌分别接种在营养培养基中均能良好的生长繁殖,但分别接种在以玉米黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素双棕榈酸酯为唯一碳源的三种有色合成培养基中均无法生长,说明5株酵母菌自身均不存在可降解玉米黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素双棕榈酸酯的酶,因此都不能直接利用3种类胡萝卜素。

图6 5株酵母菌对四种类胡萝卜素降解的影响Fig.6 Effect of Five Yeasts on the Degradation of Four Carotenoids注:1(Ⅰ)法国酿酒活性干酵母;2(Ⅱ)安琪酿酒活性干酵母;3(Ⅲ)枸杞酵母;4(Ⅳ)全美梅氏酵母;5(Ⅴ)葡萄汁有孢汉生酵母;第一排1～5号均为营养培养基;第二到四排Ⅰ～Ⅴ号以3种类胡萝卜素为有色合成培养基(从上到下依次为玉米黄素合成培养基、玉米黄素双棕榈酸酯合成培养基、β-胡萝卜素合成培养基)。

3 结论

本实验选择了具有代表性的5株不同酵母菌进行枸杞酒发酵实验,比较发酵过程中枸杞酒中主要的3种类胡萝卜素玉米黄素、玉米黄素双棕榈酸酯、β-胡萝卜素的变化。研究发现:5株酵母菌在发酵枸杞酒时,通过定时取样测定发酵过程中玉米黄素、β-胡萝卜素及玉米黄素双棕榈酸酯的变化,均有不同程度的降解,而且随着5株酵母菌发酵状态而变化,说明发酵液的状态导致类胡萝卜素发生变化。其中3种酿酒酵母(法国酿酒活性干酵母、安琪酿酒活性干酵母、枸杞酵母)由于发酵力较强,耐受乙醇高,发酵时间长,代谢产物促使发酵液体系环境发生较大的变化,使得极不稳定的各类胡萝卜素发生较大程度的降解。2株非酿酒酵母由于发酵力弱、耐受乙醇低,很快就结束了发酵,对发酵液体系环境的影响相对酿酒酵母较小,从而类胡萝卜素发生降解率就较小。此外,通过唯一碳源降解实验判定5株酵母菌均不能直接利用类胡萝卜素导致其降解。综上所述,枸杞酒发酵过程中,发酵环境的变化是影响类胡萝卜素变化的重要因素。而环境变化大小,取决于酵母的发酵力。