响应面优化碱醇预处理麦草酶解效率及木质素组分分离

周 静,沈葵忠,*,房桂干,2,邓拥军

(1.中国林业科学研究院林产化学工业研究所,国家林业局林产化学工程重点开放性实验室,生物质化学利用国家工程实验室,江苏南京 210042;2.南京林业大学林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏南京 210037)

木质纤维生物质是重要的可再生资源[1]。我国作为农业大国,每年会产生大量的稻草、麦草等农业秸秆生物质,利用农业秸秆等生物质为原料制备可发酵性糖类,进而制备燃料乙醇及其他化学品,提高其附加值,对缓解能源危机和保护环境具有重要意义[2-3]。麦草等农业秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素三大组分构成,三者之间存在复杂的化学键连接,形成的天然复杂高分子结构,对生物酶具有很强的抵抗能力,使得直接对其酶解糖化效率极低。需要经过一定的预处理操作打破其致密结构,增加生物酶对底物的可及性,从而提高酶解效率[4]。木质素属于芳香族化合物,广泛存在于植物界中且含量丰富,有巨大潜在应用价值[5]。但由于其结构缺少重复单元之间的有序性和规律性,结构复杂,造成木质素开发利用的困难,至今没有得到很好的利用。

目前常用的预处理方法主要有酸法预处理[6]、蒸汽爆破预处理[7]、高温热水预处理[8-9]、有机溶剂预处理等[10]。其中,有机溶剂预处理与其他预处理相比,具有选择性,受到研究人员的关注。乙醇是一种常用的有机溶剂,且可通过蒸发能回收循环使用。但不使用催化剂的乙醇预处理温度较高,常控制在200 ℃左右,并在后续洗涤步骤中,因体系温度降低溶出的木质素会吸附在物料表面导致较难洗净等缺点[11]。碱性乙醇预处理麦草秸秆,碱溶液中OH-可断裂木质纤维原料中酯键、醚键等化学键,使木质素大分子降解溶出[12]。可在较温和的条件下将木质素从物料中分离并显著提高物料的酶解糖化效率,并对预处理液中的木质素进行回收,以期实现秸秆类原料的全组分高值化利用。

本文使用氢氧化钠为催化剂的碱性乙醇溶液为预处理药剂,以预处理后物料的酶解总糖转化率为响应值,采用响应面法对实验条件进行了优化,建立了预处理工艺数学模型,确定了最佳预处理工艺条件。并通过对物料化学组分及结构形貌的分析,解释了预处理使物料酶解率提高的原因。通过对降解溶出的木质素进行了回收提纯和结构表征,为碱醇木质素的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

麦草 取自山东枣庄农村,水洗除尘后风干,植物粉碎机粉碎,筛选0.180～0.425 mm的颗粒;纤维素酶(Celluclast 1.5 L,酶活127 FPU/mL)、β-葡萄糖苷酶(Novozyme 188,酶活350 IU/mL) Novozymes公司,酶活按文献[13]提供的方法测定;氢氧化钠、乙醇等 均为分析纯,购买于国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖、木糖标准品 均为色谱纯,购买于国药集团化学试剂有限公司。

反应釜 采用型号为316 L的优质不锈钢加工而成,内套为对位聚苯材料,购自巩义市孝义合众仪器有限公司;T6新世纪紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;傅里叶红外光谱(FT-IR)仪 THERMO SCIENTIFIC;Agilent 1100色谱仪 美国安捷伦公司;Aminex HPX-87H色谱柱 美国伯乐公司;S-3400型扫描电镜 日本东芝公司。

1.2 实验方法

1.2.1 碱醇预处理及木质素的组分分离 将6 g麦草加入反应釜,称取一定量氢氧化钠溶于体积分数为50%的乙醇溶液,保持固液比为1∶10 (g∶mL)。在设定的温度反应一定时间,将反应釜取出放入冷水中冷却至室温。真空抽滤使固液分离,收集滤液,固体物料用蒸馏水洗涤至中性,室温风干储存于聚四氟乙烯塑料袋中用于化学成分分析和酶解使用。滤液用6 mol/L的HCl调节至pH2,有固体析出,在6000 r/min转速下离心沉降回收得粗木素,按照Bjorkman方法提纯[14],得碱醇木质素。为比较木素结构的变化,提取麦草原料中的磨木木素(MWL)作为参照。

1.2.2 酶解 称取绝干质量0.3000 g碱醇木质素置于50 mL锥形瓶中,根据前期的初步实验研究,加入20 FPU/g纤维素酶和20 IU/gβ-葡萄糖苷酶,加入12 mL pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液,使固液比为1∶40,并加入一滴丙酮以防止水解过程中杂菌和微生物产生。将上述样品置于50 ℃、150 r/min恒温培养振荡器中酶解48 h。反应结束后,将锥形瓶置于沸水浴中煮沸10 min,对其中残存的纤维素酶灭活,采用HPLC测试酶解液中的糖含量。酶解总糖转化率计算见公式(1)。

总糖转化率(%)=(酶解得到的葡萄糖(g)×0.9+酶解得到的木糖(g)×0.88)/(底物中葡聚糖(g)+底物中木聚糖(g))×100

式(1)

式中:0.9和0.88分别是葡萄糖转化为葡聚糖和木糖转化为木聚糖时的转化系数。实验中以葡萄糖和木糖表示总糖含量。因麦草中阿拉伯糖、半乳糖等含量很少,可忽略不计。

1.2.3 响应面实验设计 根据前期的初步实验研究,确定了预处理温度、碱用量和预处理时间作为影响麦草秸秆碱醇预处理的主要因素,以预处理温度、碱用量(以预处理药液中NaOH的质量分数表示)和预处理时间为自变量,每个因素取3个水平,以(-1,0,1)编码根据Box-Behnken设计原理[15],采用3因素3水平的响应面分析方法,实验因素水平见表1。

表1 响应面实验因素及编码水平设计Table 1 Factors and levels of the RSM experimental design

1.2.4 分析测试 糖含量的测定：原料的各化学组分含量按照美国可再生能源实验室(NREL)所推荐的方法测定[16]。其中糖含量分析采用高效液相色谱(HPLC)测量,葡萄糖和木糖标准糖样品经80 ℃恒重后溶于去离子水中配制系列梯度浓度,于HPLC中进样,绘制标准曲线。以糖浓度为横坐标x(mg/mL),峰面积为纵坐标 y,得到葡萄糖标准曲线:y=3.99794×10-6x+0.01456,R2=0.99992;木糖标准曲线:y=4.21963×10-6x+0.01473,R2=0.99998;检测条件为:使用Aminex HPX-87H色谱柱,柱温65 ℃,流速为0.6 mL/min,进样量20 μL,0.005 mol/L H2SO4为流动相,示差折光检测器(RI)进行检测，外标法定量。

红外光谱测定：采用溴化钾压片法。待测样干燥后与KBr混合均匀,用玛瑙研钵进行研磨,均匀后压制成片,测定其红外吸收光谱。

扫描电镜分析:物料采用乙醇梯度逐级脱水,乙醇体积分数分别为30%、50%、70%、80%和90%,每级脱水时间15 min,再用100%的乙醇脱水两次,每次15 min,低温真空干燥后,在扫描电镜上观察表面形貌并照相、加速电压15.2 kV。

1.3 数据处理

本文应用Origin 8.0软件进行分析作图,各组实验重复三次,以平均值来表示;响应面设计与分析采用Design Expert 8.06软件。

2 结果与分析

2.1 回归模型的建立及显著性检验

根据Box-Behnken 实验设计原理。共设计了15个实验点的响应面分析实验,其中12个为分析点,零点实验重复3次以估计实验误差。响应面实验设计结果如表2所示。应用Design Expert 8.06软件对表2数据进行多元回归拟合,获得总糖转化率(Y)对预处理温度(X1),碱用量(X2),预处理时间(X3)3个自变量的二次多项式回归模型为:

表2 碱醇预处理的响应面优化分析结果Table 2 Result of the RSM optimization about the AEP

式(2)

表3 响应面回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of the response surface quadratic model

2.2 模型交互项的解析

为进一步研究各因素之间的交互作用对酶解的影响程度,对二次回归模型进行响应面曲线图及等高线图分析。结果如图1～图3所示。

由图1可知,保持预处理时间为3 h,温度一定且处于较低水平时,酶解总糖转化率随碱用量的增加而增加的较快。当预处理温度达到一定值时,在较低碱用量情况下即可达到较高的总糖转化率,总糖转化率随碱质量分数的增加增长缓慢;当碱用量继续增加,总糖转化率略有降低。当碱用量一定,随着预处理温度的提高,总糖转化率增加显著,当温度继续增加,酶解总糖转化率反而会有所下降。分析图1可以发现,当温度在130～140 ℃范围内,碱用量在1.0%～1.4%范围内,酶解总糖转化率逐渐增加并达到极大值。

图1 预处理时间为3 h条件下预处理温度和碱用量对酶解总糖转化率的影响Fig.1 Effect of temperature and alkaline charges on total sugar conversion when time was 3 h

从图2可以看出,在碱用量固定为1%条件下,随着温度升高和时间的延长,酶解总糖转化率呈现递增的趋势。当预处理温度在130～140 ℃范围内,时间在2～3 h范围内,酶解总糖转化率达到区间最大值。由图3可知,当预处理温度固定为130 ℃时,碱用量对酶解总糖转化率的影响较时间显著。时间一定时,酶解总糖转化率随碱用量的增加明显增大。

图2 碱用量为1%条件下预处理温度和时间对酶解总糖转化率的影响Fig.2 Effect of temperature and time on total sugar conversion when alkaline charges was 1%

图3 温度为130 ℃条件下碱用量和预处理时间对酶解总糖转化率的影响Fig.3 Effect of Alkaline charges and time on total sugar conversion when temperature was 130 ℃

综上所述,响应面曲线图及等高线图直观地反映了各因素的交互作用对酶解总糖转化率的影响。其中预处理温度与碱用量的交互作用(X1X2)对酶解总糖转化率的影响最为显著,表现为曲面较陡;其他交互作用对酶解总糖转化率的影响不显著,表现为曲面较为平滑。这与方差分析的结果一致。

2.3 拟合优化条件的验证

由Design-Expert 8.0.6软件系统中的Box-Behnken Design设计模块中的优化功能,可得最佳预处理条件为:预处理温度139.73 ℃,碱用量1.19%,预处理时间2.37 h。此条件下的最高响应值为96.47%。为验证响应面分析法的可靠性,采用实际条件预处理温度140 ℃,碱用量1.19%,预处理时间2.37 h设置3组平行实验进行验证,酶解后总糖转化率分别为96.45%、97.23%和96.66%,均值为96.78%。在误差允许的范围内,实验值与模型优化模拟值基本一致,表明优化模型有较好可靠性。

2.4 化学组分与结构分析

2.4.1 化学成分分析 以响应面分析得出的最优条件处理麦草,得到预处理物料(PM)。对麦草原料(RM)和PM进行化学成分分析,结果如图4。以麦草原料为基准,PM中木质素去除率达84.62%,PM中木质素的比例由原料的19%减小至4.59%。Marton R等[17]研究表明,碱醇溶液高效去木质素效果有两方面原因:一方面溶剂中OH-可有效断裂物料中酯键、醚键等化学键,使木质素降解;另一方面,乙醇对木质素有较好的溶解能力,降解的木质素可快速溶于乙醇,防止木质素在原料表面的累积。从而实现较温和条件下木质素的有效分离[18]。纤维素和半纤维素在碱性溶液中,具有还原性末端基的葡萄糖基会被氧化而脱落,发生剥皮反应[19],从而也发生一定程度的降解。但由于乙醇是碳水化合物的贫溶剂,同时它还能使碳水化合物的还原性末端基异构化速度变缓,因而采用碱性乙醇为预处理试剂能抑制碳水化合物的剥皮反应,降低其在预处理过程中的无效降解,提高原料利用率[20]。由于木质素的大量去除,PM中纤维素和半纤维素比例增加,分别由原料的36.16%和22.70%提高至50.17%和28.25%。纤维素和半纤维素更多的暴露出来,增加了酶对底物的可及性,从而可提高酶水解效率。

图4 RM和PM的化学组分分析Fig.4 Chemical composition analysis for RM and PM

2.4.2 木质素的结构分析 在最优预处理条件下,收集预处理滤液,回收并提纯滤液中的木质素,得到碱醇木质素(AEL)。磨木木素(MWL)由于结构变化小,提取麦草原料的MWL作为表征时的参照。AEL和MWL的红外光谱谱图如图5所示。

图5 木质素样品(RL和MWL)的红外谱图Fig.5 FT-IR spectra of RL and MWL

从图5可看出,两种木质素的红外谱图极为相似,说明他们含有相似的化学基团。参照文献[21]对红外谱图进行解析。3384 cm-1处峰由O-H伸缩振动产生;2935、2838 cm-1位置的峰由C-H伸缩振动产生;1715 cm-1处峰由C=O伸缩振动产生;1590、1510 cm-1处峰归属于木质素中的苯环骨架;1354 cm-1处峰由C-O-C键伸缩振动产生;与MWL相比,AEL在1715和1354 cm-1位置的峰很弱,表示AEL中C=O和C-O-C两种化学键含量较少。说明预处理主要破坏了木质素中C=O键和C-O-C这两种化学键,其他化学基团得到了较好的保留,回收木质素作为预处理副产物具有较大的应用价值。

2.4.3 扫描电镜分析 粉碎麦草秸秆原料(RM)与碱醇预处理后秸秆物料(PM)的扫描电镜观察见图6所示,可以看出,粉碎麦草秸秆表面光滑,纤维饱满,结构组织紧密,表现出明显的机械剪应力作用后形态。经碱醇预处理后物料,纤维结构变化明显,变得蓬松、柔软,表面出现了大量的凹陷和裂痕,这在一定程度上可以增加物料的比表面积,有助于纤维素酶与物料的接触,改善酶解环境,从而提高了酶解效率。

图6 麦草原料(RM)和碱醇预处理后物料(PM)的扫描电镜照片(1000×)Fig.6 Images of SEM from RM and PM(1000×)

3 结论

通过响应面实验优化后的工艺参数分别为预处理温度140 ℃、碱质量分数1.19%、预处理时间2.37 h;此时物料酶解总糖转化率为96.78%,与模拟值96.47%基本一致,表明优化模型有较好可靠性。

在上述最优条件下进行化学组分及扫描电镜分析,表明碱醇预处理后可有效溶出麦草原料中的木质素,木质素溶出率达84.62%。因木质素的大量溶出,使物料表面出现了大量的凹陷和裂痕,物料比表面积增加,有助于纤维素酶与物料的接触,改善酶解环境,从而提高酶解效率。碱醇木质素的FT-IR表征表明,预处理使木质素中部分C=O键和C-O-C键发生断裂。与原料磨木木素相比,回收木质素中除C=O键和C-O-C键含量减小外,其他基团得到了较好的保留,回收木质素作为预处理副产物具有较大的应用价值。