皮肤组织蛋白酶D表达与晚期糖基化终末产物堆积的相关性研究

黄云芬 许庆芳 黎钰莹 许新雅 谢阳 夏悦 万苗坚 陆春 赖维

510630广州，中山大学附属第三医院皮肤科

晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）是蛋白质、脂类、核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖通过非酶糖化反应生成不可逆及不易降解的大分子棕色产物［1］。AGE影响人体蛋白质、脂类、核酸等物质结构和功能，是衰老相关疾病的重要病理特征。新近发现AGE在光老化皮肤中堆积，在光老化中起重要作用［2］。组织蛋白酶D（cathepsin D，CatD）是降解AGE的重要蛋白酶之一［3］，但它是否在光老化皮肤AGE降解及堆积中起作用，目前还不清楚。本研究采用免疫组化和免疫荧光双染法，检测并比较CatD和AGE在不同年龄组曝光和非曝光部位皮肤中的表达，并对它们之间的相关性进行分析，初步探讨CatD在光老化皮肤AGE降解及堆积中的作用。

材料与方法

一、实验材料

1.皮肤组织标本来源：皮肤组织标本均来自中山大学附属第三医院皮肤科病理活检术及皮肤外科手术切除的皮肤组织，患者均未患糖尿病。如为非肿瘤良性病变，则切取皮损周边正常皮肤；如为可疑恶性肿瘤手术，先经术中冰冻切片检查确认肿瘤边界后，再切取周边未受累正常皮肤。本研究经过中山大学附属第三医院医学伦理委员会批准（［2017］2-11），所有提供标本的患者均签署知情同意书。

2.试剂和仪器：一抗兔抗人CatD-IgG抗体、鼠抗人AGE-IgG抗体（美国Abcam公司），驴抗鼠二抗和羊抗兔二抗、Hoechst33342染料（美国Life Technology公司）。

二、方法

1.免疫组化染色检测CatD和AGE在各年龄段曝光和非曝光部位皮肤组织中的表达：受试者分为15～20岁、35～40岁、55～60岁、75～80岁4个年龄段，每年龄段又分为非曝光组和曝光组，共8组，每组6份标本。曝光部位主要取自患者的面部及前臂皮肤，非曝光部位取自胸背部、臀部、大腿等处皮肤。取4%多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织块，切片，常规脱蜡至水。乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液热修复，以含0.1%Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次。5%脱脂奶粉封闭30 min后加入50 μl兔抗人CatD IgG抗体、鼠抗人AGE IgG抗体（1∶200稀释）一抗，4℃孵育过夜。PBS漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG和山羊抗兔IgG抗体孵育1 h。二氨基联苯胺（DAB）显色1～3 min，清水漂洗。苏木素复染1 min。实验重复3次。图像采集系统400倍下连续拍照，以Image-Pro Plus 6.0图像系统分析，每张切片随机选取10个高倍视野（×400），测定阳性区域图像的积分吸光度（IOD）值。平均吸光度值=IOD值/面积。

2.免疫荧光双染法检测CatD和AGE在各年龄组曝光和非曝光皮肤组织中的表达：实验分组同上，每组6份标本。取液氮保存的皮肤组织，冰冻切片至5 μm，冷丙酮固定10 min，PBS漂洗3次。以5%脱脂奶粉封闭30 min后，加入50 μl（1∶200稀释）兔抗人CatD一抗，4℃孵育16 h，室温复温，PBS漂洗。再加入50 μl（1∶200稀释）鼠抗人AGE一抗，4℃孵育16 h，室温复温，PBS漂洗。然后同时加入1∶1 000稀释的两种荧光二抗，于37℃孵育1 h。PBS漂洗后，用1∶2 000稀释的Hoechst 33342染核2 min。所有照片均在暗室用荧光显微镜（×200）拍摄。用Image-Pro Plus 6.0图像系统分析阳性表达的面积比值，阳性面积＜0.1%示阴性（-），0.1%～＜1%示弱阳性（+），1%～＜10%示阳性（++），≥ 10%示强阳性（+++）。

3.统计学处理：采用SPSS 20.0统计软件。计量资料采用双因素方差分析，若两因素无交互作用，采用随机区组设计方差分析；若两因素有交互作用，则采用析因设计方差分析。等级资料采用非参数检验，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。AGE堆积与CatD表达相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、免疫组织化学染色检测CatD和AGE在各年龄段曝光和非曝光皮肤组织中的表达及相关性分析

免疫组化结果显示，加入CatD抗体后，真皮成纤维细胞、血管内皮细胞、炎症细胞、表皮角质形成细胞和毛囊皮脂腺细胞胞质被染成黄褐色。AGE主要表达于真皮成纤维细胞、血管内皮细胞、角质形成细胞等细胞胞质及真皮基质的胶原纤维和弹性纤维。非曝光组CatD较同年龄曝光组染色深，且随着年龄增加，CatD染色逐渐由深褐色变成浅褐色，胞质内CatD的表达逐渐减少。曝光组AGE染色较非曝光组染色深，分布范围更广，且随着年龄增长，AGE染色逐渐加深。见图1。

各组皮肤组织中CatD的平均吸光度值见表1。析因方差分析显示，曝光对CatD表达的影响有统计学意义（F=58.70，P＜0.001），曝光组的CatD表达水平低于非曝光组。年龄对CatD表达的影响亦有统计学意义（F=79.49，P＜0.001），且CatD表达水平随着年龄的增长而降低。曝光与年龄对CatD的表达有交互作用（F=6.08，P=0.002）。进一步分析单独效应，在固定年龄因素各水平条件下，除了15～20岁年龄组，其他年龄组对应的曝光组和非曝光组间CatD表达差异均有统计学意义（均P＜0.001），在固定曝光因素各水平条件下，不同年龄组间差异亦均有统计学意义（均P＜0.001）。

析因方差分析显示，曝光对AGE表达的影响有统计学意义（F=158.18，P＜0.001），曝光组AGE的表达水平高于非曝光组（表2）。年龄对AGE表达的影响亦有统计学意义（F=106.06，P＜ 0.001），且AGE表达水平随着年龄的增长而升高。曝光与年龄对AGE的表达有交互作用（F=24.50，P＜0.001）。进一步分析单独效应，除了15～20岁年龄组，其他各年龄段曝光组与非曝光组间AGE表达水平差异均有统计学意义（均P＜0.001）。在固定曝光因素各水平条件下，不同年龄组间差异均有统计学意义（均P＜0.001）。

Pearson相关系数及简单线性回归分析显示，曝光皮肤中AGE和CatD表达呈负相关，r=-0.915，P＜0.05，简单线性回归方程为Y=-2.501X+0.088；非曝光皮肤中为两者亦呈负相关，r=-0.730，P＜0.05，简单线性回归方程为Y=-0.989X+0.044。上述方程中X为CatD、Y为AGE的平均吸光度值。

二、免疫荧光双染法检测CatD和AGE在各年龄段曝光和非曝光皮肤组织中表达差异

结果见表3和图2。与免疫组化相比，免疫荧光双染法更清晰地显示CatD主要在真皮表达，AGE也主要在真皮堆积，两者的位置有很好的一致性。

Wilcoxon秩和检验显示，曝光组与非曝光组CatD荧光表达强度差异有统计学意义（Z=-2.469，P=0.014），且非曝光组CatD荧光表达强度高于曝光组。Kruskal-Wallis秩和检验显示，不同年龄组CatD荧光表达强度差异有统计学意义（H=29.25，P＜0.001），随着年龄增长，其表达强度减弱。

Wilcoxon秩和检验显示，曝光组与非曝光组AGE荧光表达强度差异有统计学意义（Z=-3.017，P=0.003），非曝光组AGE荧光表达强度低于曝光组。Kruskal-Wallis秩和检验显示，不同年龄组AGE荧光表达强度差异有统计学意义（H=12.83，P=0.005），随年龄增长，其表达强度增加。

讨 论

既往认为AGE性质稳定，但最近研究发现，AGE可以降解，其降解途径是通过被巨噬细胞、成纤维细胞等胞吞后被泛素蛋白酶体或溶酶体蛋白酶降解，而CatD在其中起重要作用［3］。CatD属于天冬氨酸蛋白酶，是溶酶体内含量最丰富（浓度高达1 mmol/L）的蛋白酶，组织蛋白酶B和L酶原转化为活性酶均有赖于CatD催化［4］。CatD还含有很强降解变性蛋白的肽链内切酶，与公认能降解AGE的胃蛋白酶有类似化学结构，且AGE在溶酶体酸性环境中变性后更易与蛋白水解酶的肽键结合被降解［3］。更重要的是，CatD可直接参与并调控细胞自噬，进而调控AGE在溶酶体内的降解［5］。Stolzing等［6］用AGE连接牛血清白蛋白（AGE-BSA）孵育体外培养神经小胶质细胞，发现AGE-BSA能被胞吞，然后被胞内20S蛋白酶体和溶酶体酶降解。但Bulteau等［7］发现，AGE主要结构之一N-羟甲基赖氨酸可抵抗20S蛋白酶体降解。Grimm等［3］采用纯化CatD、B以及20S蛋白酶体等分别孵育AGE，发现20S蛋白酶体完全不能降解AGE，CatD、B能降解AGE，其中CatD降解活性显著高于CatB。随后，他们又研究鼠胚胎成纤维细胞和巨噬细胞系RAW264.7对胞外AGE的降解，发现CatD在降解吞入胞内的AGE中起重要作用［8］。我们的前期研究发现，光老化皮肤和皮肤成纤维细胞中CatD表达均降低［9］，但CatD表达降低是否与光老化皮肤AGE堆积相关还不清楚。

图1 免疫组化染色检测组织蛋白酶D（CatD）和晚期糖基化终末产物（AGE）在各年龄段曝光和非曝光皮肤组织中的表达（×200） 各曝光组CatD的表达均随年龄增加而显著下降，而AGE的沉积则随年龄增加而显著增多；曝光组CatD的表达均较同年龄非曝光组显著降低，而曝光组AGE沉积均比同年龄非曝光组显著升高

表1 各年龄段曝光和非曝光部位皮肤组织中组织蛋白酶D的平均吸光度值（±s）析因方差分析结果

表1 各年龄段曝光和非曝光部位皮肤组织中组织蛋白酶D的平均吸光度值（±s）析因方差分析结果

注：n=6。a主效应；b交互效应

组别非曝光组曝光组合计F值P值15～20岁0.032±0.007 0.032±0.004 0.032±0.005 0.041 0.841 35～40岁0.032±0.005 0.020±0.005 0.026±0.008 22.132＜0.001 55～60岁0.026±0.002 0.012±0.004 0.019±0.008 32.633＜0.001 75～80岁0.013±0.004 0.002±0.001 0.007±0.007 22.132＜0.001合计0.026±0.009 0.016±0.012-58.699a＜0.001a F值25.422 53.149 79.492a 6.079b P值＜0.001＜0.001＜0.001a 0.002b

表2 各年龄段曝光和非曝光部位皮肤组织中晚期糖基化终末产物的平均吸光度值（±s）析因方差分析结果

表2 各年龄段曝光和非曝光部位皮肤组织中晚期糖基化终末产物的平均吸光度值（±s）析因方差分析结果

注：n=6。a主效应；b交互效应

15～20岁0.006±0.001 0.007±0.003 0.007±0.002 0.044 0.835 35～40岁0.010±0.003 0.030±0.008 0.020±0.012 18.820＜0.001 55～60岁0.021±0.004 0.066±0.010 0.044±0.025 95.982＜0.001 75～80岁0.035±0.009 0.085±0.015 0.060±0.029 116.841＜0.001合计0.018±0.012 0.047±0.032-158.184a＜0.001a F值15.581 114.983 106.063a 24.501b P值＜0.001＜0.001＜0.001a＜0.001b

表3 免疫荧光双染法检测晚期糖基化终末产物和组织蛋白酶D在各年龄段曝光和非曝光皮肤组织中的表达（例）

图2 免疫荧光双染检测晚期糖基化终末产物（AGE）和组织蛋白酶D（CatD）在各年龄段曝光和非曝光皮肤组织中的表达（×200） 绿色荧光示CatD阳性表达，红色荧光示AGE阳性表达，Hoechst将细胞核染成蓝色，“重叠”为以上3种荧光的融合

我们发现CatD和AGE在不同年龄段曝光和非曝光部位皮肤表皮、真皮中都有表达。AGE主要累及更新率缓慢、富含赖氨酸的蛋白质。人皮肤胶原蛋白、弹性蛋白代谢缓慢，并含较多赖氨酸及羟赖氨酸，它们是皮肤发生糖化反应的主要蛋白［10］。本研究也证实，随年龄增长，曝光和非曝光皮肤中增多的AGE主要沉积于真皮。AGE在机体生成要经历漫长的非酶糖化反应过程，但ROS和高血糖可促进AGE生成［11］。ROS在紫外线照射皮肤组织中显著升高［12］，因此紫外线加速了皮肤AGE生成。本研究也发现，曝光组AGE沉积显著高于同年龄非曝光组，推测光老化很可能也抑制了AGE降解。本研究还发现，在＞35岁各年龄段中，曝光组皮肤CatD表达均显著低于同年龄段非曝光组，且在曝光各组皮肤中CatD和AGE表达分别随年龄增长依次递减和递增，提示皮肤CatD和AGE表达与光老化程度密切相关。相关性分析显示，AGE和CatD在曝光皮肤中的表达呈高度负相关，而在非曝光皮肤中呈中度负相关，表明慢性紫外线照射很可能通过抑制皮肤CatD表达阻碍AGE降解，提示可通过调控CatD表达来干预AGE堆积，从而改善光老化。我们前期研究发现，外用含0.001%CatD的凝胶于光老化皮肤2周，可显著上调光老化皮肤CatD含量和改善光老化皮肤外观［13］，其机制是否与外用CatD凝胶促进光老化皮肤AGE降解有关还有待进一步研究。

成纤维细胞在细胞外基质新陈代谢中起重要作用。已有研究揭示，皮肤成纤维细胞膜高表达AGE受体［14］，意味着成纤维细胞可通过AGE受体胞吞胞外AGE，而胞内CatD对光老化皮肤AGE降解起重要作用。我们采用实时RT-PCR和Western印迹法检测并对比CatD在光老化和非光老化皮肤成纤维细胞中的表达，证明光老化皮肤成纤维细胞中CatD mRNA和蛋白表达均显著降低［9］。光老化皮肤成纤维细胞是否对吞入胞内的AGE降解减少、有无其他蛋白酶在皮肤成纤维细胞降解胞内AGE中起作用等还有待深入研究。