恒温扩增芯片法在儿童下呼吸道感染性疾病中的应用价值评估

王咏红 郭雅洁 陈玉莹 马 琦 李洁琼

儿童下呼吸道感染病原构成复杂，患儿临床症状缺乏特异性，难以通过临床特征进行诊断[1，2]。临床目前用于下呼吸道感染的实验室诊断方法主要是细菌培养和血清学检测，而现有的诊断方法仅能检测出30%～40%的病原[3-5]，亟需研发新的诊断方法以提高诊断敏感度。

PCR是现阶段临床使用的病原快速筛选方法[6-8]，其中，恒温扩增芯片法(芯片法)通过环介导恒温扩增，利用具有链置换功能的聚合酶在恒温(65℃)条件下进行反应，简单易行。呼吸道病原菌核酸检测试剂盒采用了恒温扩增芯片技术，可定性检测临床13种常见下呼吸道病原菌[9]。本研究利用恒温扩增芯片技术，分析首都医科大学附属北京儿童医院(我院)住院患儿下呼吸道病原菌分布情况，并比较该方法与培养法和抗体法的一致性，旨在为临床提供更为快速可靠的实验室诊断依据。

1 方法

1.1 研究设计 采集下呼吸道感染住院患儿的痰液等分泌物标本，采用芯片法快速检测13种病原，并与培养法和血清学检测的检出率进行比较。本研究经我院医学伦理委员会批准，涉及的检查均取得了患儿监护人的知情同意。

1.2 纳入标准 ①2017年1～7月于我院住院的患儿；②符合下呼吸道感染的诊断标准[10]。

1.3 芯片法病原检测 采用呼吸道病原菌核酸检测试剂盒(北京博奥生物集团有限公司，批号：360090)。患儿于入院当天采集分泌物标本(痰液、胃液、支气管肺泡灌洗液、鼻咽分泌物、咽拭子或脑脊液)，置于一次性无菌痰杯中，不少于0.6 mL。提取核酸，配置恒温扩增试剂，将恒温扩增试剂盒核酸充分混匀进行恒温扩增，随后加入到芯片主通道中，将加样后的芯片固定在低速离心机上，以6 000 r·min-1离心30 s后取下进行核酸扩增及检测。试剂盒采用ROC法计算得到13种待检病原(流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、结核分枝杆菌复合群、肺炎支原体、嗜肺军团菌和肺炎衣原体)的参考值，将各病原指标的参考值整合至试剂盒判断软件中，由软件对样品检测结果进行自动判读。当检测指标的扩增时间值≤该病原指标的参考值时判读为阳性，余判读为阴性。

1.4 痰培养 收集合格痰标本(即所有标本进行镜检，要求白细胞数>25/低倍视野且上皮细胞<10/低倍视野)。将痰标本分别接种于血平板、加万古霉素巧克力平板、麦康凯平板和罗氏培养基，于35℃、5% CO2条件培养，一般细菌培养24 h或48 h，结核分枝杆菌需培养3～4周，观察培养基并筛选可能的致病菌进行鉴定。

1.5 血清学检测 采用日本富士瑞必欧株式会赛乐迪亚-麦可Ⅱ试剂盒(SERODIA-MycoⅡ；珠海丽珠试剂股份有限公司；批号S20040076)，以颗粒凝集法检测肺炎支原体(MP)IgM和IgG的混合体。按试剂盒说明加入血清稀释液。MP-Ab滴度≥1∶160为阳性结果。

采用德国欧蒙公司生产的呼吸道病原体谱诊断试剂盒，以间接免疫荧光法检测衣原体和军团菌IgM抗体水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计数资料采用例数和百分比表示，检出率比较采用相关样本的配对χ2检验；计量资料采用均数±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 研究期间应用芯片法共检测了230例下呼吸道感染住院患儿，男134例(58.3%)，女96例(41.7%)，平均年龄(8.1±3.8)岁；肺炎90例，支气管肺炎68例，支气管炎48例，毛细支气管炎23例，肺结核1例。

2.2 芯片法检测结果 表1显示，230例患儿中共检出病原阳性的患儿182例(79.1%)，其中，单一病原感染33.5%(77/230)，以流感嗜血杆菌单一感染最常见(28.6%)；混合感染45.6%(105/230)，以耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌混合感染为主，且以2种病原混合感染最多见(64/230，27.8%)。

13种常见呼吸道病原菌中，检出阳性率最高的病原依次为耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体和肺炎克雷伯菌，大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌的感染率均<10%。未检测到结核分枝杆菌复合群、嗜肺军团菌和肺炎衣原体。

10种病原以混合感染为主，其中铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌未见单一感染，均与其他呼吸道病原菌混合感染存在。肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄单胞菌与其他病原共感染的概率均>80%(表1)。

表1 芯片法检测13种常见病原情况[n(%)]

2.3 芯片法与培养法病原检出率比较 行芯片法检测的230例患儿中，212例同时进行了常规病原体分离培养。其中，芯片法检测到9种常见病原(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌和流感嗜血杆菌)，培养法阳性检出率为34.0%(72/212)，芯片法为77.8% (165/212)，差异有统计学意义(P<0.001)。表2显示，对于流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌，芯片法较培养法可分别多检出40、37、22和12例标本，两种方法的检出率差异有统计学意义。对于铜绿假单胞菌和大肠埃希菌，两种方法的检出率差异无统计学意义。对于下呼吸道感染中感染率相对较低的鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌，两种方法的阳性检出率均较低，差异无统计学意义。芯片法可检测到的耐甲氧西林葡萄球菌包括耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐甲氧西林溶血葡萄球菌等多种类型，培养法只能培养鉴定获得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的结果，因此未进行统计学比较。

恒温扩增芯片检测的患儿中，有68例进行了结核分枝杆菌培养，其中1例培养阳性，而芯片法未检出结核分枝杆菌，差异无统计学意义。

表2 芯片法与培养法对儿童下呼吸道病原检出情况比较

注 1)：培养法只能检测出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染

2.4 芯片法与血清学检测对儿童肺炎支原体、嗜肺军团菌和肺炎衣原体的检出情况 行芯片法检测的230例患儿中，202例样本同时进行了肺炎支原体、嗜肺军团菌和肺炎衣原体血清学检测。芯片法检出肺炎支原体25例(12.4%)，其中4例为血清学检测阴性；血清学肺炎支原体检出24例(11.8%)，其中3例为芯片法检测阴性，两种方法的检出率差异无统计学意义(χ2=0,P=0.705)。两种方法均未检出嗜肺军团菌和肺炎衣原体。

3 讨论

恒温扩增芯片技术是Notomi等在2000年开发的一种新型恒温核酸扩增方法，主要针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，通过链置换DNA聚合酶在约65℃恒温条件下可完成核酸扩增反应[11]。该方法无需经过模板的热变性、长时间温度循环、电泳、紫外观察等过程，仅需1 h即可完成实验，与传统痰培养法比较，大幅缩短了检验周期。本研究采用的呼吸道病原菌核酸检测试剂盒利用恒温扩增芯片技术，为中国自主研发的试剂盒，在感染性疾病中具有较大的诊断价值[11,12]，已在国内许多医院使用，但未见非中文相关研究报道。

本研究对230例下呼吸道感染患儿分泌物样本的检测结果发现，芯片法检测13种常见呼吸道病原菌，其中耐甲氧西林葡萄球菌(33.8%)、流感嗜血杆菌(27.8%)、肺炎链球菌(22.6%)，金黄色葡萄球菌(19.5%)，肺炎支原体(11.7%)和肺炎克雷伯菌(11.3%)的检出率较高，而大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌的检出率不到10%。与本研究结果不同，刘志远等[13]对94例痰标本进行了芯片法检测，结果发现流感嗜血杆菌(13株)是下呼吸道感染的主要致病菌，其次为肺炎链球菌(10株)和铜绿假单胞菌(9株)。陈愉生等[14]利用芯片法检测成人下呼吸道病原，结果显示，铜绿假单胞菌(21株)、流感嗜血杆菌(20株)、肺炎克雷伯菌(20株)和肺炎链球菌(12株)是下呼吸道感染的主要致病菌，提示成人的下呼吸道常见病原与儿童存在差别。另外，本研究中耐甲氧西林葡萄球菌的检出率较高，耐甲氧西林葡萄球菌包含的种类较多，如耐甲氧西林金黄色色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐甲氧西林溶血葡萄球菌和耐甲氧西林人葡萄球菌等，因此，结果部分未与培养法进行比较。

本研究中，芯片法检测了9种可用传统培养方法培养的细菌(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌)和1种需特殊培养基培养的细菌(结核分枝杆菌)。目前的培养方法，操作过程复杂且时间较长，很难达到早期快速诊断的目的。虽然采用培养法进行病原学诊断是诊断下呼吸道感染的金标准，但是目前培养法在儿童下呼吸道感染诊断中的阳性率很低，而芯片法能从微量拷贝中获得目的基因，敏感度较高。以流感嗜血杆菌为例，本研究培养法的阳性率仅为7.5%，很多临床确诊为流感嗜血杆菌的患儿难以通过培养法获取病原学证据。如果以培养法为金标准，芯片法测出为阳性的很多患儿，会被判定为假阳性，导致芯片法的特异性低，因此用培养法作为金标准评判芯片法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值会存在误差。为了更直观地比较，本研究评价了两种方法对于各种病原菌的检出率，而非采用敏感度和特异度表示。结果显示，芯片法对病原体的检出率明显高于培养法，特别是对于流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。与本研究结果类似，刘志远等[13]采用芯片法检出63株病原体，培养法检出10株病原体，培养阳性率明显低于芯片法。芯片法能从微量拷贝中获得目的基因，故检出率高于培养法。然而，并不是所有能检测到病原体DNA的标本，都判断为阳性，芯片法设定有一个TP(time of positive)值，即在一定时间内扩增拷贝数达到一定的数量，才可判读为阳性，可以更好地与定植菌区分。目前病原检出率低是困扰儿童下呼吸道感染性疾病诊断的主要问题之一，芯片法有较高的阳性检出率，在儿童下呼吸道病原检出方面具有一定的优势，从而更好地指导临床医生合理用药。唐睿珠等[15]发现，芯片法的阳性率高于培养法。李松等的研究中，机械通气新生儿下呼吸道病原检出率，芯片法的阳性率高于培养法[16]。芯片法较培养法对儿童下呼吸道感染病原体检出率高的可能原因：①芯片法能从微量拷贝中获得目的基因，敏感性高；②培养条件要求较高，特别是儿童，传统痰培养难以获取病原体；③部分病原体如流感嗜血杆菌，由于易受用药的影响，因此培养阳性率低；④培养技术要求专业的培养基以及技术人员[15]。

本研究中，对于铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌，芯片法和培养法的检出率差异无统计学意。与本研究不同，李松等发现，两种方法对嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞菌的检出率不一致[16]。这可能是由于研究对象不同导致的，新生儿感染中医源性感染比例较高，感染类型与本研究不同，另外由于样本量较小，需要扩大样本量进一步验证。此外，在68例进行了结核分枝杆菌培养的患儿中，有1例培养阳性，而芯片法为阴性，可能是芯片法检测假阴性。结核分枝杆菌培养条件苛刻，特别对于儿童来说，结核分枝杆菌培养阳性率较低，而理论上芯片法检测的是病原体DNA，能从微量拷贝中获得目的基因，敏感性要高于培养，为何出现培养法阳性而芯片法阴性的情况，有待进一步思考和研究。

芯片法还可检测3种非常规培养的病原体：肺炎支原体、嗜肺军团菌和肺炎衣原体。这3种病原体主要依靠血清学方法进行检测，但通常在病程1～2周后，血清中才会出现相应抗体，对临床的实际诊治价值有限。将这3种病原体整合到芯片中，可达到快速诊断的目的。本研究同时进行恒温扩增芯片和血清学检测的202例患儿中，芯片法未检出军团菌和衣原体，检出25例肺炎支原体，其中21例血清学方法亦为阳性，支原体检出的符合率较高。

综上所述，与培养法相比，芯片法可快速诊断感染病原菌，阳性检出率高，并可检测肺炎支原体、军团菌和衣原体等病原体。芯片法为儿童下呼吸道感染的诊断以及鉴别诊断提供了更为敏感、有效和简便的方法。