卡泊三醇预处理对氨基酮戊酸局部外用后裸鼠正常上皮中原卟啉IX含量的影响

严文杰 云健健 黄熙

541001桂林医学院附属医院皮肤性病科（严文杰、黄熙）；湖北省襄阳市中医医院皮肤性病科（云健健）

目前局部氨基酮戊酸-光动力疗法（ALA-PDT）广泛用于治疗表皮异常增生的皮肤肿瘤。近来局部ALA-PDT被尝试应用于光老化等非增殖性皮肤病时也显示出一定疗效［1］。为了提高局部ALA-PDT的疗效，往往采用ALA促渗剂或光敏剂增效剂促进ALA代谢转化为原卟啉IX（PpIX）。其中铁螯合剂及维生素D3类似物为研究中常用的光敏剂增效剂。已有研究证实，维生素D3类似物预处理可以提高小鼠表皮肿瘤［2］及银屑病患者［3］皮损中PpIX含量和疗效，且卡泊三醇预处理裸鼠皮肤可显著增加PpIX荧光强度［4-5］。本研究旨在观察卡泊三醇预处理对ALA作用后不同时间裸鼠正常上皮组织中PpIX含量变化的影响，探讨卡泊三醇能否作为局部ALA-PDT的增效剂。

材料与方法

一、主要试剂及仪器

ALA散（规格118 mg，上海复旦张江生物医药股份有限公司），PpIX［250 mg，Aladdin-阿拉丁试剂（上海）有限公司］，抗荧光衰减封片剂（5 ml，北京索莱宝科技有限公司），0.005%卡泊三醇软膏（规格10 g，中国香港澳美制药厂），荧光分光光度计［RF-5301pc，北京岛津企业管理（中国）有限公司］，倒置荧光相差显微镜（日本OLYMPUS公司），半微量天平（MS105DU，瑞士Mettler Toledo公司）。

二、实验动物

成年健康雌性4～6周龄BALB/C裸鼠（动物合格证号45000800000014）36只，体重25～30 g，由桂林医学院实验动物中心提供，在25～27℃无菌恒温、恒湿（45%～50%）的半屏障系统环境下饲养。实验前腹腔注射1%戊巴比妥（100 mg/kg）麻醉。

三、实验方法

1.动物分组及处理：将36只裸鼠随机分为ALA组和卡泊三醇+ALA组，每组18只。卡泊三醇+ALA组裸鼠整个后背皮肤外涂卡泊三醇软膏，每天1次，连用3 d；ALA组未做任何处理。3 d后在两组裸鼠的后背皮肤均用亚甲兰和聚维酮碘标记1处1.5 cm×1.5 cm区域为实验区域。将118 mg ALA溶解于0.472 ml灭菌注射用水，配制20%（质量分数）ALA溶液，两组实验区域均放置等面积2层纱布，将0.5 ml ALA溶液滴于纱布上，塑料薄膜封包，锡纸包扎后避光放置。外用ALA后2～7 h内每小时各处死3只裸鼠，并迅速手术切取实验区域组织，等分为3份，其中1份做冰冻切片，另2份用于检测裸鼠组织PpIX含量。

2.裸鼠组织PpIX含量检测：①标准液配制及标准方程确定：结合张波等［6］的方法配制标准液。Matlab多项式拟合得出标准方程y=0.029 6X4－0.145 0X3＋0.275 1X2－0.225 3X＋0.068 8，其中X为PpIX荧光强度对数值，y为抽提液PpIX浓度（mg/L），拟合度0.998 9，曲线拟合成立；组织PpIX含量（Yt）=y×抽提液体积/组织质量（ng/g组织）；②样品组织PpIX含量检测：取2份相似组织称重后分别放入不同的陶瓷研钵内，加入适量液氮研磨成粉，加入Hepes缓冲液混匀后，移入离心试管中，加入5 ml乙酸乙酯与冰醋酸（4∶1）混合液混匀，134×g离心1 min，取上清液，并加入4 ml 0.5%（体积分数）盐酸，剧烈振摇、混匀，134×g离心1 min，静置，待充分分层后，取下层液体用荧光分光光度计检测，根据上述公式计算PpIX含量。

3.裸鼠组织内PpIX分布观察：取1份组织的冰冻切片，抗荧光衰减封片剂封片后，倒置荧光相差显微镜下观察PpIX分布，选择黄色激发区（BP545-580、DM600、BA610-1F），明视场对应3号滤光片，曝光指数400，观察100倍放大图像，并拍照记录。

四、统计学分析

结 果

一、裸鼠皮肤组织PpIX含量

在外用ALA后5～6 h之前PpIX含量均随时间延长逐渐增多，ALA组在第5小时达高峰，卡泊三醇+ALA组在第6小时达到峰值，见图1。单因素方差分析显示，两组内不同时间点PpIX含量差异均有统计学意义（ALA组F=55.76，P＜0.01；卡泊三醇 +ALA组F=145.61，P＜0.01）。相关性分析显示，ALA组PpIX含量与时间无显著相关性（r=0.451，P=0.37），但卡泊三醇+ALA组PpIX含量与时间呈强相关（r=0.913，P=0.01）。在外用ALA后2～7 h时两组间PpIX含量差异均有统计学意义，t值依次为2.311、2.764、3.028、3.241、12.978、13.235，P＜ 0.05或0.01。

二、PpIX在裸鼠组织内的分布

正常裸鼠表皮层有微弱的荧光，见图2。ALA组和卡泊三醇+ALA组表皮和真皮组织均可观察到弥漫性PpIX荧光分布，表皮荧光强度强于真皮层，且细胞内荧光强于细胞间，荧光强度随时间逐渐增强，在2～4 h内两组间荧光强度无明显差异，在5～7 h尤其是6 h时卡泊三醇+ALA组荧光强度明显高于ALA组，见图3。

图1 氨基酮戊酸（ALA）组和卡泊三醇+ALA组裸鼠皮肤原卟啉IX（PpIX）含量比较

图2 正常裸鼠皮肤组织明视场图像（×100）

讨 论

ALA是亲水性的光敏剂前体，能渗入角质层并进入正常组织和增生活跃的靶组织，细胞内的酶促反应再将ALA转换为PpIX，PpIX是一种内源性光敏剂，当暴露于它的作用光谱后，可产生活性氧进而破坏靶细胞。尽管有研究报道［7］，ALA可以渗入小鼠正常皮肤的表皮、真皮层及真皮中的成纤维细胞、血管内皮细胞并转化为PpIX，但ALA的非亲脂性及皮肤角质层的屏障作用限制了其在皮肤中的渗透，限制了局部ALA-PDT的疗效。有两大类预处理方案可以提高局部ALA-PDT疗效，一是物理或化学方法如刮除术、微针、二甲基亚砜等，二是ALA增效剂如铁螯合剂、维生素D3类似物等。卡泊三醇、骨化三醇均属于维生素D3类似物，是治疗寻常性银屑病的常规外用药物，其安全性及耐受性良好。Sato等［8］报道，维生素D3类似物预先处理体外培养的大鼠角质形成细胞后使用ALA，不仅可以提高细胞内PpIX浓度，且增加其光敏感性。此后不断有研究证实，维生素D3类似物预处理可提高ALA-PDT在小鼠鳞状细胞癌（A431）［2］、乳腺癌［9］及口腔癌［10］模型中的PpIX含量和疗效。维生素D3类似物作为光敏剂增效剂的作用机制主要是通过增加粪卟啉原氧化酶和（或）减少亚铁原卟啉合成酶的表达使PpIX在细胞内累积增加。

图3 不同时间裸鼠皮肤组织内原卟啉IX荧光分布（×100）

为了解PpIX在组织中的分布及随时间变化情况，我们在外用ALA后第2～7小时每小时切取裸鼠皮肤组织。由于石蜡切片自发荧光强，而且在脱蜡处理中会造成PpIX丢失与荧光淬灭，所以我们制作冰冻切片后在倒置相差显微镜下观察PpIX荧光分布。本研究结果显示，在局部外用ALA 5 h后，ALA组裸鼠皮肤组织PpIX浓度最高。李晶晶等［11］发现，PpIX荧光强度在小鼠正常皮肤上随时间逐渐增强并在5 h时达到高峰，之后逐渐减弱。本研究中裸鼠上皮PpIX的浓度变化曲线与李晶晶等［11］研究结果基本一致，说明体内监测得到的荧光强度曲线在一定程度上可以反映体内组织中PpIX含量的变化趋势。虽然有文献报道［12］人体正常皮肤局部使用ALA后PpIX荧光强度在6 h时达峰值，但曲线变化趋势与本研究结果基本一致。本研究中卡泊三醇+ALA组PpIX浓度的最大值是ALA组的近1.5倍，在相同时间点6 h处，卡泊三醇+ALA组PpIX含量是ALA组的2.0倍，提示卡泊三醇可以提高正常上皮内PpIX含量，其机制可能是改变血红素合成途径中酶的活性和（或）诱导角质形成细胞分化和表皮增殖等［4］。我们进一步分析显示，卡泊三醇+ALA组7 h内PpIX含量与时间变化呈正相关，而ALA组不存在这种相关性，进一步说明卡泊三醇可改变ALA吸收过程，随时间延长促进PpIX含量增加。但本实验中从第2小时开始监测PpIX含量，如细化监测时间点，在早期（2 h内）卡泊三醇+ALA组PpIX含量是否与时间相关还需进一步研究。

在特定波长光源照射下裸鼠组织内PpIX被激发出肉眼可见的砖红色荧光，皮肤表面的荧光强度可以反映局部组织内光敏剂PpIX浓度。大部分研究往往使用表面荧光检测仪通过测定皮肤表面的荧光强度来评估组织内PpIX含量，但不能直接观察到组织内部PpIX的空间分布情况。本研究结果显示，两组小鼠上皮组织的表皮及真皮层在荧光显微镜下均发出砖红色荧光，表明表皮细胞和真皮细胞中均累积了大量PpIX，与De Bruijn等［13］通过分析荧光光谱得出的结论类似。本研究中通过肉眼可以直观地发现两组荧光强弱变化，与PpIX含量动力学变化趋势基本一致，而且6 h处卡泊三醇+ALA组荧光强度达到高峰，明显高于ALA组，表明卡泊三醇在此时明显提高了PpIX含量，而ALA组在5 h处荧光强度达到高峰后逐步衰减，表明卡泊三醇+ALA组比ALA组PpIX蓄积时间更长、蓄积量更大。PpIX荧光在表皮层较真皮层强，红色荧光主要分布于细胞内，细胞间相对较弱，这与ALA在组织细胞内的代谢途径相关。ALA进入上皮细胞及靶组织后会在线粒体中转化为PpIX，然后光敏剂PpIX从线粒体渗透到其他的细胞器和细胞质中。本研究中卡泊三醇+ALA组PpIX的荧光遍及表皮层与真皮层，如何更好地控制PpIX在皮肤各层的蓄积量，尚待进一步研究。