江西野生金线莲茎尖染色体制作技术优化

张付远，李丹丹,2，宋墩福

（1江西环境工程职业学院，江西赣州 341000；2华南农业大学，广东广州）

金线兰属Anoectochilus Bl.隶属于兰科Orchidaceae，该属植物全世界约有30种，分布于印度、喜马拉雅山东部、太平洋群岛西南部和亚洲南部、东南部到澳大利亚地区；中国有11种，其中7种为中国特有[1]。在我国金线兰属植物常被称为“金线莲”[2]。金线莲通常又称花叶开唇兰、金线兰、鸟人参，是珍稀名贵中草药，可全草入药，性平味甘，清热凉血，祛风利湿，可用于治疗支气管炎、肾炎、结核性脑膜炎、咳血、小儿急惊风、风湿性关节炎等症[3-4]。但是金线莲对生态环境要求严格，且数量少，远不能满足需求[5]。因此，国内已通过组培快繁方法建立无性系植株，目前对金线莲的研究还只限于植物学描述、资源评价、化学有效成分、药理机制、药效成分的提取工艺、组培快繁、栽培及少部分分子标记的研究，曾雅娟等[6]（2001）曾有报道了金线莲的染色体核型属不对称“2 A”类型，核型公式2n=40=38m+2sm。但是图像不够清晰。

为了给金线莲育种和栽培提供详细遗传背景资料，现对其染色体进行观察，并在结合前人染色体制片技术的基础上，用金线莲组培瓶苗茎尖体为材料，得到了简单有效稳定的染色体制片方法，以期为金线莲的种质资源分类、遗传关系远近鉴定、种质资源创新及利用等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用材料为江西野生金线莲Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.组培瓶苗的茎尖，取自江西环境工程职业学院花卉中心。

1.2 方法

1.2.1 取材。取金线莲组培幼苗，切取1cm左右长的茎尖。从8∶30～17∶30，每隔2h取材1次。

1.2.2 预处理。将根尖置于0.1%的秋水仙素中分别预处理 1h、2h、4h、6h。

1.2.3 固定保存。将预处理过的茎尖放入卡诺液中固定24h，用自来水冲洗5遍，可以直接进行解离，如暂时不做解离可保存在70%酒精中，于4℃冷藏备用。

1.2.4 解离。固定过的茎尖置于1mol/LHCl中在60℃恒温水浴锅中进行解离，解离时间设定为5min、10min和15min。

1.2.5 染色。将解离好的茎尖用蒸馏水冲洗5遍，并用改良的苯酚品红染色液进行染色，染色时间设定为4min、8min、16min。

1.2.6 压片镜检。切取茎尖分生区部分置于载玻片上，盖上盖玻片，先用镊子轻敲，最后用铅笔的橡皮头敲盖玻片使染色体均匀分散。将压好的片子置于显微镜下镜检，寻找到清晰的细胞中期分裂相并拍照取像。

2 结果与分析

2.1 不同染色时间对染色体观察的影响

结果表明，采用改良的苯酚品红溶液染色4min时，染色体着色比较浅；染色8min时，染色体染色清晰，细胞质不染色或颜色较淡，染色效果较佳；而当染色16min时，背景的清晰度较差，较难观察染色体。

2.2 不同解离时间对染色体制片的影响

不同解离时间对制片效果的影响见表1，结果发现，经1mol/L的HCl在60℃下解离10min时，金线莲茎尖细胞分散较好，染色体清晰。解离5min时，染色体互相重叠，无法清晰分辨染色体。解离15min时，部分细胞破裂，染色体出现缺失或混杂。

表1 不同解离时间的效果比较

2.3 不同预处理时间对染色体制片的影响

如表2所示，经0.1%的秋水仙素预处理2h后，可获得到较多的染色体形态清晰的中期分裂相细胞。预处理1h时，染色体过长，相互重叠交叉，不利于观察；预处理4～6h时染色体过分收缩，影响染色体形态。

表2 不同预处理时间的效果比较

2.4 不同取材时间的影响

观察不同取材时间的对压片效果的影响（预处理2h、解离10min、染色8min），统计处于分裂中期的细胞所占比例（见表3）。结果表明金线莲根尖的最佳取材时间为9∶30。

表3 不同取材时间的效果比较

3 讨论

根尖压片法是植物染色体研究中应用最为广泛的常规技术，使用茎尖较少，但是金线莲种子小，选取胚根上的根尖比较难，加上金线莲大部分采用组培快繁方法，根尖上培养基较难洗干净，造成取材困难，效果较差。而茎尖比较容易取材，经本研究发现效果较好，可以作为金线莲染色体制备方法。

本试验结果表明，于9∶30切取金线莲幼苗的茎尖，用0.1%的秋水仙素预处理2h，经卡诺液固定4h后，用 1mol/L HCl于 60℃下解离10min，再用改良的苯酚品红溶液染色8min后进行压片，能获得染色体分散良好、形态清晰的压片（图1，400x下拍照观察）。