北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备

刘倩茹，柏圣达，赵国雨，徐云峰，杨最素

（浙江海洋大学食品与医药学院／浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心，浙江 舟山 316022）

鱿鱼是海洋生物中重要的头足类动物，其生长周期短、繁殖能力强及资源恢复迅速，是一种可持续发展的海洋渔业资源。近年来，随着国内外深海捕捞技术的发展，鱿鱼业已成为中国主要的远洋捕捞和水产加工品种。目前，中国年鱿鱼加工量达40～50万t，居世界第一位，加工品种主要为阿根廷鱿鱼、北太平洋鱿鱼和秘鲁鱿鱼。鱿鱼的肉细腻，风味鲜美，富含高蛋白低脂肪，包含人体所需的多种必需氨基酸，备受消费者青睐。在鱿鱼的加工过程中，一般对其胴体进行加工，产生约有35%的鱿鱼头、内脏及表皮等下脚料，除部分加工成鱼粉外，一般都采用掩埋处理，造成资源的大量浪费，因此学者们对如何综合利用鱿鱼下脚料开展了广泛的研究［1］。现有的研究结果表明，鱿鱼皮胶原蛋白的小分子肽具有良好的降血压、调血脂、抗氧化等多种生理功能，在食品、医疗及保健品方面具有良好的应用前景［2，3］。 鱿鱼墨多肽具有抗肿瘤活性［4］，鱿鱼墨黑色素铁能够显著促进大鼠造血细胞的生长，改善缺铁性贫血大鼠的贫血症状，是贫血类保健食品的良好原料［5，6］。鱿鱼内脏含较高的牛磺酸、维生素和锌等成分，可作为强化食品的原料，作为制造酱油或天然调味品的原料［7，8］。 而生殖腺（缠卵腺、精巢、卵巢等）占内脏的20%，这些内脏等副产物，通常被加工成饲料，作为鱼的诱饵［9］；鱿鱼缠卵腺等通常只作烹饪食用，生物附加值低并且未及时处理会对环境造成一定的污染。研究表明，雄性鱿鱼精巢组织提取物具有抗疲劳、抗氧化及免疫调节功能，在海洋保健食品中有广阔的应用前景［10］。精巢中可获得鱼精蛋白，具有抑制多种食品腐败菌的生长，且具有促消化、助呼吸、降血压、抑制肿瘤生长等生理活性，鱼精蛋白因其良好的天然性和抗菌性受到广泛关注，已作为化学防腐剂的替代品出现在食品添加剂行列［11］。关于鱿鱼雌性生殖腺——缠卵腺的研究不多，王倩等［12，13］、刘淑集等［14］从鱿鱼缠卵腺中提取糖蛋白，发现其具有较好的抗疲劳、降血脂及提高非特异性免疫的功能，但关于鱿鱼缠卵腺酶解多肽的提取目前鲜见报道。本研究以鱿鱼缠卵腺为原料，通过优化的酶解方法提取多肽，评价其体外的抗氧化活性，以期为鱿鱼缠卵腺的开发利用提高试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北太平洋鱿鱼（Todarodes pacificus）缠卵腺，购于舟山本地水产品企业；碱性蛋白酶购于亚太恒信生物科技（北京）有限公司；1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH）购于西亚试剂；菲洛嗪、邻二氮菲、三氯化铁、磷酸氢二钠购于阿拉丁试剂公司；其余试剂均为分析纯购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SSW－420－2S恒温水浴锅 （上海民仪电子有限公司）；BSA124S型电子天平 （德国SartoriusAG公司）；DS－1 组织捣碎机 （上海标本模型厂）；PHS－250PH计（上海理达仪器厂）；CF16RXⅡ型高速低温离心机 （日本日立公司）；Direct－Q 5 UV－R型超纯水系统和Cogentk®μ Scale型超滤系统 （美国Millipore 公司）；ALPHA 1－4／LDplus 型冷冻干燥机（德国 CHRIST 公司）；紫外分光光度计（752FC）（上海光谱仪器有限公司）；Agilent－1260型高效液相色谱仪 （美国安捷伦公司）；PPSQ－31A蛋白自动测序仪（日本岛津制作所）。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验 选用碱性蛋白酶进行酶解试验，考虑酶解的温度、时间、加酶量、溶液pH和料液比5个因素，将试验分成5组进行，每组均取相同量（10 g）的鱿鱼缠卵腺匀浆5份，比较碱性蛋白酶在不同水解条件下的水解度，以水解物的ANN含量为指标，从而确定较为适合的碱性蛋白酶水解条件范围。氨基氮含量（ANN）与水解度成正相关，采用甲醛电位滴定法测定。

水解工艺：鱿鱼缠卵腺捣碎→匀浆→1 mol／L氢氧化钠调pH→保温→加酶后水解→灭酶（90℃加热15min）→离心（10000r／min、15min）→上清液定容→游离氨基氮含量（AAN）测定。

1）温度。 料液比 1∶6，调 pH 至 8，加 2 500 U／g的酶，在不同温度下（30、35、40、45、50 ℃）酶解 7 h。

2）时间。 料液比 1∶6，调 pH 至 8，加 2 500 U／g的酶，在 45 ℃下恒温酶解不同时间（5、6、7、8、9 h）。

3）加酶量。料液比为1∶6，调pH至8，加入不同量（1 500、2 000、2 500、3 000、3 500 U／g）的酶，在45 ℃下恒温酶解7 h。

4）pH。 料液比为 1∶6，调至不同 pH（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0），加 2 500 U／g 的酶，在 45 ℃下恒温酶解7 h。

5）料液比。 加不同料液比（1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7），调pH至8，加2 500 U／g的酶，在45℃下恒温酶解7 h。

1.3.2 正交试验 经单因素试验确定较优试验条件范围，考虑 5 个因素，即温度（A）、时间（B）、pH（C）、加酶量（D）和料液比（E），选取 L16（45）的正交试验，用DPPH清除率来评价不同水解条件下的抗氧化活性。

1.3.3 酶解液超滤 使用超滤杯截取分子量分别为3、5、8、10、30 ku 的超滤膜，将酶解液在 25 ℃环境中分别超滤 12 h，截取获得＜3 ku、3～5 ku、5～8 ku、8～10 ku、10～30 ku和＞30 ku分子量的酶解液，冷冻干燥后分别测定抗氧化活性。

1.3.4 测定方法 酶解液对DPPH清除率的测定参照文献［15，16］并进行适当改进。酶解液对·OH自由基清除率的测定参照文献［17－19］并进行适当改进。酶解液对O2－清除率的测定参照文献［20－22］并进行适当改进，酶解液对Fe2＋螯合能力的测定参照文献［22－24］并作适当改进。酶解液还原能力的测定参照文献［23－25］并作适当改进。

1.3.5 Sephadex G－25层析分离 取抗氧化活性最佳的多肽分子段，冻干样品后进行琼脂糖凝胶G－25层析分离，样品浓度为0.2 g/mL，离心后留取上清液，过0.22 μm滤膜后进行洗脱。洗脱柱尺寸2.6 cm×60 cm；以琼脂糖凝胶G－25填料；柱料颗粒为50～150 μm；上样量 2 mL；取去离子水为洗脱液；流速1.1 mL/min；收集体积为 3.5 mL/管，在 280 nm 处收集各个峰的组分后再进行冷冻干燥，并检测抗氧化活性（以DPPH清除率为标准）。

1.3.6 高效液相分离纯化及目标肽N端序列测定根据上一步各个峰对DPPH清除率的检测得到最佳活性峰组分，大量收集此峰经HPLC反复制备，获得单一峰后，委托北京亿谱生物技术有限公司完成蛋白质的N端序列检测工作。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 温度 如图1所示，当酶解温度在30～45℃之间，生成的北太平洋鱿鱼缠卵腺ANN会逐渐增多，45℃时达到最高，而到50℃有所下降。因此，正交试验选择的温度范围为40～50℃。

图1 温度对太平洋鱿鱼缠卵腺ANN的影响

2.1.2 时间 如图2所示，当酶解时间在6 h时，生成的北太平洋鱿鱼缠卵腺ANN最多，7 h后逐渐减少。因此，选择酶解时间在5～7 h。

2.1.3 pH 如图3所示，当pH为9.0时生成的北太平洋鱿鱼缠卵腺 ANN 最多，pH 为 8.0、10.0 时，生成的ANN相差不大，因此正交试验选择pH在8.0～10.0。

2.1.4 加酶量 加酶量单因素试验结果如图4所示。当加酶量位于1 500～3 500 U/g，生成的北太平洋鱿鱼缠卵腺ANN随加酶量的增加而增加，可能加入的酶越多，酶与原料接触越充分，效果也越好。因此，正交试验选择加酶量位于2 500～3 500 U/g。

2.1.5 料液比 料液比单因素试验结果如图5所示。当料液比为 1∶3～1∶7时，随着料液比的增加，生成的北太平洋鱿鱼缠卵腺ANN逐渐减少。因此，正交试验选择料液比在 1∶3～1∶5。

图2 时间对太平洋鱿鱼缠卵腺ANN的影响

图3 pH对太平洋鱿鱼缠卵腺ANN的影响

图4 加酶量对太平洋鱿鱼缠卵腺ANN的影响

图5 料液比对太平洋鱿鱼缠卵腺ANN的影响

2.2 碱性蛋白酶酶解条件的优化

在初步确定酶解条件的基础上，选择温度、pH、时间、料液比和加酶量5个因素设计4水平正交试验L16（45），确定最佳酶解工艺，结果见表 1。由表1可知，影响碱性蛋白酶水解物羟自由基清除率的各因素中，由大到小排列顺序为B＞A＞E＞D＞C，即时间＞温度＞料液比＞加酶量＞pH，而且组合A4B3C3D4E4效果最好，即选择温度50℃、酶解时间7 h、加酶量3 500 U/g、pH 9.0、料液比为 1∶6 为最佳酶解条件。

表1 碱性蛋白酶的酶解正交试验结果

2.3 酶解物最佳分子段的选取

将最佳水解条件下得到的水解物经超滤后分离得到＜3 ku、3～5 ku、5～8 ku、8～10 ku、10～30 ku、＞30 ku不同分子量的多肽，经冷冻干燥，检测浓度为0.5 mg/mL时酶解多肽的还原能力、羟自由基清除率、DPPH清除率、超氧阴离子清除率、Fe2＋螯合率，测定结果见图6。从图6至图10可以看出，不同分子量的酶解多肽均有一定的抗氧化能力，但以3～5 ku的酶解多肽清除率最高。因此，下步试验将选取该分子段进行分离纯化。

2.4 Sephadex G-25分离纯化结果

取3～5 ku分子段冻干样品进行琼脂糖凝胶Sephadex G－25层析，于280 nm处出现3个峰，即峰玉、峰Ⅱ和峰Ⅲ，结果见图11。分别收集3个峰组分经冷冻干燥，当浓度为0.5 mg/mL检测其对DPPH的清除率，得出峰玉有较好的清除能力，结果见图12，取峰玉分子段进行HPLC的纯化。

图6 酶解多肽不同分子段的还原能力

图7 酶解多肽不同分子段对羟自由基的清除率

图8 酶解多肽不同分子段对DPPH的清除率

图9 酶解多肽不同分子段对超氧阴离子清除率

图10 酶解多肽不同分子段的Fe2+螯合率

图11 3～5 ku分子段在280 nm处的吸光度

图12 3～5 ku分子段的DPPH清除率

2.5 HPLC分离纯化及目标肽N端序列测定结果

峰玉经HPLC色谱柱反复制备，结果如图13所示。保留时间约为11.8 min时，出现单一峰，经氨基酸序列仪N端序列检测，其氨基酸序列为Ala－Tyr－Ala－Ser－Ser，相对分子质量为 497.50，其结构式见图14。

图13 峰玉在219 nm处的高效液相色谱

图14 目标肽氨基酸分子结构式

3 小结

以北太平洋鱿鱼缠卵腺为试验原料，结合单因素试验和正交试验，筛选出碱性蛋白酶的酶解条件，即温度50℃、酶解时间7 h、加酶量3 500 U/g、pH 9.0且料液比1∶6。影响碱性蛋白酶水解物DPPH清除率的各因素中，时间＞温度＞料液比＞加酶量＞pH。酶解液经超滤获得不同分子段，经抗氧化试验得出最佳抗氧化分子段为3～5 ku。经琼脂糖凝胶G－25层析后，得出3个峰，根据对DPPH清除率的测定，得出峰玉效果明确，当浓度为0.5 mg/mL时其DPPH的清除率为61.87%，后经HPLC分离纯化并经目标肽N端序列检测，得到该目标肽的氨基酸序列为 Ala－Tyr－Ala－Ser－Ser。 因此，认为应用现代生物制备技术酶解北太平洋鱿鱼缠卵腺，可获得抗氧化活性较好的寡肽，发现其内在的价值，增加其附加值，避免优质蛋白的大量流失，可为鱿鱼缠卵腺的精深加工和高值化利用开拓一条新的途径。