淬灭胃癌SGC-7901细胞内活性氧对维生素E琥珀酸脂诱导内质网应激的影响

黄晓莉，吴 坤，赵莎莎

（1．山东大学齐鲁医院营养科，山东济南250012；2．哈尔滨医科大学营养与食品卫生教研室，黑龙江 哈 尔滨 150081）

维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然维生素E的第6位羟基被琥珀酸所替代，并脱去1个水分子形成的酯类化合物。体内外研究发现VES作为一种潜在的肿瘤化学预防和治疗剂，能够通过死亡受体介导的外源性途径、线粒体介导的内源性途径、MAPK、氧化应激等机制诱导不同肿瘤细胞发生凋亡[1-3]。近年来，活性氧(reactive oxygen species，ROS)和内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)作为关键的信号分子和信号途径在抗肿瘤研究中越来越受到重视[4-5]。ERS发生时，细胞可通过启动未折叠蛋白反应来提高自身的生存能力，但是若应激刺激过强或过久，未折叠蛋白反应反而会激活相应的凋亡机制，诱导细胞凋亡[5]。我们前期研究发现VES能够诱导胃癌SGC-7901细胞发生内质网应激和未折叠蛋白反应，并能够增加SGC-7901细胞内ROS的含量[3，6-7]。本文拟探讨VES处理人胃癌细胞后淬灭ROS对细胞内质网应激的影响，旨在深入阐明VES诱导人胃癌细胞凋亡过程中ROS与内质网应激的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

VES和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)购自Sigma公司；RPMI-1640培养液购自Gibco公司；葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulative protein，GRP78)多克隆抗体和C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)单克隆抗体均购自Cell Signaling公司；β-actin购自Santa Cruz公司；逆转录-PCR试剂盒购自TaKaRa。

MCO-17A型CO培养箱购于Sanyo公司；AllegraTM

2 64R低温高速离心机和DUR 640核酸蛋白分析仪均购于Beckman公司；C1Si型激光共聚焦显微镜购自上海衡桥仪器有限公司；FACScan (Becton Dickinson)型流式细胞仪购于贝克曼库尔特商贸有限公司；分子杂交箱购于Amersham Life Science；ChemilmagerTM4000数字凝胶成像系统购于Alpha Innotech公司。

1.2 细胞培养与分组

人胃癌SGC-7901细胞购自北京肿瘤研究所，细胞在含有10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养液中，于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中常规培养。VES溶于无水乙醇中，配制为10 mg/mL的储备液，4 ℃避光保存。处理细胞时用2% RPMI-1640培养液稀释成20 μg/mL，含有0.1%乙醇的RPMI- 1640培养液为溶剂对照，并设有VES处理组、NAC处理组和NAC+VES联合处理组。

1.3 检测细胞内ROS含量

不同浓度(1、5、10和20 mmol/L)NAC作用胃癌SGC-7901细胞2 h，再加入20 μg/mL VES处理12 h，无血清培养液与2´，7´-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(2´，7´-dichlorodihydro-fluorescein diacetate， DCFH-DA) 以1∶ 1 000 比例混合，使DCFH-DA终浓度为10 μmol/L。缓慢冲洗细胞后，加入稀释好的DCFH-DA溶液，37℃培养箱内孵育20 min，每隔5 min轻轻摇匀1次。PBS缓慢冲洗细胞3次后，激光共聚焦显微镜检测荧光强度，发射波长为525 nm，激发波长为488 nm。DCFH-DA进入细胞后生成二氯二氢荧光素(dichlorodihydrofluorescein，DCFH)，细胞内的ROS可以使无荧光的DCFH氧化生成有荧光的二氯荧光黄(diemorofluorescein，DCF)，激光共聚焦显微镜观察可见绿色荧光，ROS含量越高则荧光强度越强。另将20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901细胞2 h，再加入20 μg/mL VES处理细胞12 h，经DCFH-DA染色后，流式细胞术检测细胞内ROS水平的变化，方法同上。

1.4 逆转录PCR(RT-PCR)法检测mRNA表达

20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901细胞2 h，再加入20 μg/mL VES处理15 h后，收集细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书进行逆转录。引物序列：β-actin，上游5´-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA A-3´，下游5´-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3´，扩增产物为540 bp；GRP78，上游5´-GATAATCAACC AACTGTTAC-3´，下游5´-GTATCCTCTTCACCAGTTGG-3´，扩增产物为577 bp；CHOP，上游5´-GCACCT CCCAGAGCCCTCACTCTCC-3´，下游5´-GTCTACTCC AAGCCTTCCCCCTGCG-3´，扩增产物为422 bp。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳及溴化乙啶染色、拍照，并进行灰度值分析。

1.5 Western blot法检测蛋白表达

20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901细胞2 h，再加入20 μg/mL VES处理24 h后，收集细胞，用冷的PBS冲洗2次，悬浮于细胞裂解液中，冰上裂解30 min，采用Bio-Rad DC Protein Assay测定上清液中蛋白质含量，等量蛋白上样，经10%SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白分离，低温转移至PVDF膜上，封闭液封闭2 h后，分别加入一抗和碱性磷酸酶标记的IgG二抗，孵育后加显色底物，数字成像仪扫描成像，并进行灰度值分析。

1.6 统计学方法

每组实验至少重复3次，采用SPSS 16.0软件进行数据处理和分析。通过ANOVA方差分析进行组间比较，各组之间的两两比较采用LSD法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 激光共聚焦显微镜观察胃癌SGC-7901细胞ROS水平

激光共聚焦显微镜观察见图1。结果表明，20 μg/mL VES使细胞内ROS含量明显升高，而经不同浓度NAC预处理之后，与单纯VES处理组相比，10 mmol/L NAC预处理组细胞内ROS开始降低，20 mmol/LNAC预处理组降低最为明显。

图1 激光共聚焦显微镜观察SGC-7901细胞内ROS水平

2.2 流式细胞术检测胃癌SGC-7901细胞内ROS水平

见图2。结果表明，与对照组比较，20 μg/mL VES明显促进细胞内ROS的生成，而20 mmol/L NAC预处理能明显降低ROS的产生，与激光共聚焦显微镜检测的结果一致，差异均具有统计学意义(P均＜0.05)。

图2 流式细胞术检测SGC-7901细胞内ROS水平

2.3 淬灭细胞ROS对内质网应激相关分子GRP78和CHOP mRNA表达的影响

见图3。结果表明，20 μg/mL VES能够提高GRP78和CHOP mRNA水平，而20 mmol/L NAC显著抑制VES对GRP78和CHOP mRNA表达的诱导作用。

2.4 淬灭细胞ROS对内质网应激相关分子GRP78和CHOP蛋白表达的影响

见图4。结果表明，20 μg/mL VES能够提高胃癌SGC-7901细胞内GRP78和CHOP蛋白水平，而20 mmol/L NAC显著抑制VES对GRP78和CHOP蛋白表达的诱导作用。

3 讨论

内质网作为真核细胞重要的亚细胞器，参与蛋白质的合成、加工、运输及脂类的合成和储存等重要生理功能。各种生理和病理刺激条件下，未折叠或折叠错误的蛋白积聚在内质网内，可诱发内质网应激反应。如果内质网应激反应损伤严重，则激活相应的凋亡机制，诱导细胞发生凋亡[5]。ROS产生增加或抗氧化防御系统受到损伤时，细胞处于氧化应激状态，也可以引起细胞凋亡[4]。有研究发现内质网应激诱导糖尿病肾病小鼠管状上皮细胞凋亡过程中，ROS发挥了非常重要的作用[8]。也有报道显示亚硒酸钠诱导人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞和脱氢甲基还氧醌霉素诱导肝癌细胞发生的内质网应激是氧化应激的下游事件[9-10]。另有研究却发现葡萄糖诱导的内质网应激并未依赖氧化应激，相关研究结论并不一致[11]。我们前期研究已经发现VES能够诱导胃癌SGC-7901细胞发生内质网应激和未折叠蛋白反应，并能够增加SGC-7901细胞内ROS 的含量，本文则探讨VES处理人胃癌细胞后淬灭ROS 对内质网应激的影响。

图3 NAC对内质网应激相关分子mRNA表达的影响及灰度值分析

图4 NAC对内质网应激相关分子蛋白表达的影响及灰度值分析

NAC作为一种巯醇化合物，是细胞内还原型谷胱甘肽的前体，可以促进谷胱甘肽合成，增强谷胱甘肽S转移酶的活性，对氧自由基反应直接作用并促进解毒，是一种非常强的抗氧化剂，可以抑制细胞内ROS的产生[12]。本研究中20 μg/mL VES能够显著促进胃癌SGC-7901细胞内ROS的生成，20 mmol/L NAC预处理细胞2 h可以明显抑制ROS的产生，验证了NAC清除ROS的作用，并通过探讨VES处理胃癌细胞后NAC对内质网应激的影响，进而阐明VES诱导人胃癌细胞凋亡过程中ROS与内质网应激的关系。

GRP78分布在内质网腔内，可识别错误折叠蛋白，协助蛋白质折叠、伸展、组装和转运，帮助未折叠蛋白定位于内质网腔，具有内质网标志性分子伴侣的功能[13]。CHOP是内质网应激特异性转录因子。在非应激状态下，CHOP表达水平很低；发生内质网应激后，CHOP表达水平显著增加[14]。本研究发现20 μg/mL VES能够显著诱导GRP78和CHOP mRNA 及蛋白的表达，与前期结果一致。而通过NAC淬灭胃癌SGC-7901细胞内ROS后，20 μg/mL VES对GRP78和CHOP mRNA及蛋白表达的促进作用均被显著抑制。因为GRP78和CHOP都是内质网应激非常特异的信号分子，所以本研究结果提示VES诱导的内质网应激可能依赖于ROS的生成。Kadara等[15]同样发现，维胺脂引起人头颈癌细胞ROS的形成可以引起内质网应激反应。还有研究发现维生素C和NAC等抗氧化剂能够抑制牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)引起的肾近端小管上皮细胞GRP78水平上升[16]。同样也有与本研究结果不同的报道。抗氧化剂维生素C和维生素E并不能逆转高浓度葡萄糖作用人脐带上皮细胞引起的内质网应激[17]。本研究仅初步探讨VES作用胃癌细胞后淬灭活性氧对内质网应激的影响，详细的机制仍需要进一步探讨。