纳米银和PVP包被纳米银对HepG2细胞遗传毒性的比较研究

王秀娟，李婷竹，陆强，苏雪荣，薛玉英,*，唐萌

1. 环境医学工程教育部重点实验室，南京 210009 2. 东南大学公共卫生学院 & 苏州纳米科技协同创新中心，南京 210009 3. 江苏省生物材料与器件重点实验室，南京 210009

随着纳米技术的飞速发展，纳米产品层出不穷。在众多的纳米材料中，纳米银因其优良的抗菌杀菌性能被广泛应用于医疗卫生、食品加工、化妆品、陶瓷、纺织、半导体材料，水质净化等领域[1]。广泛的应用使人体暴露纳米银的机会大大增加，有研究表明，纳米银可能与体内不同组织、细胞或生物分子产生相互作用[2-5]，带来潜在的安全隐患，评估其生物安全性至关重要。

遗传毒性在安全性评价中不可或缺，有研究者用粒径为55 nm的纳米银对SD大鼠在其怀孕的第7～20天，每天分别以 0、0.2、2、20 mg·kg-1的剂量进行灌胃，结果发现纳米银可穿越胎盘屏障，到达胎鼠体内，并引起孕鼠及子鼠体内氧化应激水平的改变[6]。Wen等[7]用纳米银(6.3～629 nm)对大鼠以5 mg·kg-1的剂量进行静脉染毒，结果发现与空白对照组相比实验组大鼠染色体断裂和多倍体细胞率显著增加，表明纳米银具有潜在的遗传毒性。Tavares等[8]用纳米银(5～45 nm)染毒人外周血细胞，彗星实验结果表明在各染毒剂量下(10、25、50 μg·mL-1)纳米银均会对细胞产生基因毒性作用，但随着时间的推移纳米银对DNA的损伤逐渐减少，说明在低剂量染毒细胞时，随着时间的增加，纳米银对细胞造成的遗传毒性会因为细胞修复系统而降低。目前，关于纳米银的体外遗传毒性研究还不是很充分，有待进一步探索。

本研究选择人肝癌(HepG2)细胞株为研究对象，以无包被纳米银和PVP包被纳米银为材料，通过彗星实验和胞质分裂阻滞微核细胞组学试验研究纳米银对DNA、染色体的影响，从多遗传终点和遗传毒作用机制角度出发，通过分析、比较2种纳米银的遗传作用特征，较全面地分析纳米银遗传毒性的剂量-效应关系，为纳米材料体外遗传毒性评估提供实验依据。此外，本研究确定了由彗星实验与胞质分裂阻滞微核细胞组学试验结合的方法，利用HepG2细胞作为体外评价模型，能方便快速检测纳米银材料的遗传毒性效应，进而可以利用该组合实验筛检市场中纳米材料的遗传毒性效应。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料与细胞

20 nm PVP包被纳米银粉体(上海沪正纳米科技有限公司)，20 nm 无包被纳米银粉体(上海允复纳米科技有限公司)，重铬酸钾(K2Cr2O7，国药集团化学试剂有限公司)，阳性对照丝裂霉素C(Mitomycin C, MMC, Sigma-Aldrich公司)，HepG2细胞株(Human hepatoma cell line，人肝癌细胞，中国科学院上海细胞生物研究所)。

1.2 试剂

DMEM高糖培养液(美国GE公司)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，博士德生物工程有限公司)，细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，Oxiselect彗星实验试剂盒(Oxiselect comet assay kit，美国Cell Biolabs公司)，TE缓冲液(北京天恩泽生物技术有限公司)，氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)，氢氧化钠(国药集团化学试剂有限公司)，75%酒精(永华化学科技(江苏)有限公司)，细胞松弛素-B(Cytochalasin B，Cyt-B，CAS：14930-96-2，美国Sigma -Aldrich 公司)，吉姆萨粉末(Giemsa，中国Biosharp公司)。

1.3 主要仪器

3423型CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)，TDZ6B-WS水平离心机(上海卢湘仪器厂)，5424R型离心机(德国Eppendorf公司)，KQ-2200E型超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)，FSX100型智能生物图像导航仪(日本OLYMPUS公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养

HepG2细胞使用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素)于37 ℃、CO2体积分数为5%条件下常规传代培养。

1.4.2 Hoechst-33258染色测细胞凋亡

将洁净盖玻片置于6孔板内，取对数生长期的细胞接种于6孔板，调节细胞浓度为1×105个·mL，每孔2 mL，培养过夜，使其密度至50%～80%满。后分别用20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1的纳米银染毒细胞。24 h后，吸尽培养液，加入0.5 mL固定液，固定10 min，去固定液。用PBS洗2遍，每次3 min，吸尽液体。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，置摇床上染色5 min。去染色液，用PBS洗2遍，吸尽液体。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。在生物导航仪上观察细胞。

1.4.3 彗星实验

取对数生长期的细胞接种于12孔板，调节细胞密度至1×105个·mL，每孔1 mL。培养24 h后吸去原培养液，空白对照组加入细胞培养液，阳性对照组加入294 μg·mL-1的重铬酸钾溶液，实验组分别加入20、40、80、160 μg·mL-1的纳米银溶液，继续培养24 h后，收集细胞。按照彗星实验试剂盒操作说明检测DNA损伤。实验重复3次，每次实验每个剂量随机选择50个细胞用Comet Assay软件(CASP，http://casplab.com/)分析。3次实验的Olive尾矩、尾长和尾部DNA百分比的平均值用以表达DNA损伤。

1.4.4 胞质分裂阻滞微核细胞组学试验

取对数生长期的细胞接种于12孔板，调节细胞密度至1×105个·mL，每孔1 mL。培养24 h后吸去原培养液，实验组分别加入20、40、80、160 μg·mL-1的纳米银溶液，阳性对照组加入0.1 μg·mL-1的丝裂霉素C，胞质阻滞松弛素B在染毒时同时加入，浓度为4 μg·mL-1，染毒24 h后，吸去染毒液将细胞固定滴片，后用Giemsa 染液进行染色，最后用生物导航仪读片，对2种纳米银每个染毒剂量均观察3次不同区域的细胞，每次观察1 000个双核细胞，统计1 000个细胞中总微核(Ⅰ型微核+Ⅱ型微核)、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核芽、核质桥的数量。

1.5 统计学方法

2 结果(Results)

2.1 纳米银表征结果

透射电镜(TEM)检测结果如图1所示，通过TEM观察到分散于10%胎牛血清的DMEM培养液中的2种纳米银颗粒均为球形，无包被的纳米银有团聚现象，PVP包被的纳米银分散均匀，无团聚现象。通过Nano Measurer 1.2.5 软件测量20 nm无包被纳米银平均粒径为(18.29±5.50) nm，20 nm PVP包被的纳米银平均粒径为(19.95±4.75) nm。

2.2 纳米银对HepG2细胞凋亡的影响

生物导航仪读片可见阳性对照组凋亡细胞比较多，各处理组有少量的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，其他都为正常的细胞核形态，正常细胞核内DNA分布相对均匀，细胞核无固缩，在视野中呈现体积较大的且染色颜色较浅的核形态，纳米银对HepG2细胞核形态的影响见图2，各实验处理组HepG2 细胞凋亡率结果见表1。

图1 纳米银颗粒TEM图注：A, 20 nm AgNPs的TEM图； B, 20 nm-PVP AgNPs的TEM图。Fig. 1 The TEM diagram of nano silver particlesNote: A, the TEM diagram of 20 nm AgNPs; B, the TEM diagram of 20 nm-PVP AgNPs.

图2 不同特性纳米银对HepG2细胞核形态的影响注：Hoechst 33258染色，×100，箭头所指为凋亡细胞的细胞核。A，空白对照组；B，阳性对照组；C1～C4，20 nm AgNPs组(剂量分别为20, 40, 80, 160 μg·mL-1)；D1～D4，20 nm PVP-AgNPs组(剂量分别为20, 40, 80 160 μg·mL-1。Fig. 2 The influence of different characteristics of nano silver on the nuclear form of HepG2Note: Hoechst 33258 staining, ×100; the arrow refers to the nucleus of apoptotic cells. A, blank control group; B, positive control group; C1-C4, 20 nm AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1); D1- D4, 20 nm PVP-AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1).

表1可知，与正常对照组比较，20 nm AgNPs组在剂量为160 μg·mL-1时凋亡细胞核相比于空白对照组明显增多(P<0.05)；20 nm PVP-AgNPs的80 μg·mL-1、160 μg·mL-1组凋亡细胞核相比于空白对照组明显增多(P<0.05，P<0.01)。2种纳米银使HepG2细胞呈浓度依赖性的细胞凋亡(20 nm AgNPs：P<0.05，r=0.997；20 nm PVP-AgNPs：P<0.05，r=0.999)。析因设计方差分析比较可知，20 nm PVP-AgNPs对HepG2细胞凋亡的影响大于20 nm AgNPs(P<0.05)。

图3 彗星图像(×42)注：A，空白对照组；B，阳性对照组；C1～C4，20 nm AgNPs组(剂量分别为20, 40, 80,160 μg·mL-1)；D1～D4，20 nm PVP-AgNPs组(剂量分别为20, 40, 80,160 μg·mL-1)。Fig. 3 The comet image (×42)Note: A, blank control group; B, positive control group; C1-C4, 20 nm AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1); D1- D4, 20 nm PVP-AgNPs group (20, 40, 80,160 μg·mL-1).

表1 不同特性纳米银对HepG2细胞凋亡率的影响Table 1 The effect of silver nanoparticles with different properties on the apoptosis rate of HepG2 cells

注：与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.01。Note: Compared with the control group,aP<0.05，bP<0.01.

2.3 纳米银对DNA损伤的影响

实验所得彗星图像见图3，空白对照组彗星头部DNA致密，无尾部；阳性对照组头部DNA集中，亮度很强，尾部由DNA断片组成呈扫帚状，荧光强度不及头部。2种纳米银处理组中小于等于40 μg·mL-1剂量组均能观察到头部DNA致密，无明显尾部或尾部很短；大于等于80 μg·mL-1的各个剂量组的彗星头部DNA集中，亮度较强，尾部成呈扫帚状，荧光强度不及头部。利用彗星分析软件(Comet Assay Software Project, CASP)进行数据分析，2种不同包被纳米银的不同浓度的Olive尾矩、尾长和尾部DNA百分比结果见表2。

由单因素方差分析结果可知，在染毒24 h后，阳性对照组Olive尾矩、尾长和尾部DNA百分比与空白对照组对比有显著差异(P<0.01)。20 nm AgNPs组中除了20 μg·mL-1的Olive尾矩与尾长，其余均与空白对照组有显著差异(P<0.05)，20 nm PVP-AgNPs组除了20 μg·mL-1的DNA百分比，其余均与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)。析因设计方差分析比较可知，2种纳米银使HepG2细胞DNA断裂程度：20 nm AgNPs > 20 nm PVP-AgNPs(P<0.05)。

2.4 纳米银对细胞核的影响

如图4，胞质分裂阻滞微核细胞组学试验中，纳米银引起细胞核出现Ⅰ型微核数、Ⅱ型微核、核芽、核质桥等特征性改变，不同特性纳米银染毒HepG2细胞微核组学效应见表3。

如表3所示，与阴性对照组相比，20 nm AgNPs 在80 μg·mL-1、160 μg·mL-1浓度下染毒HepG2细胞后微核总数显著升高 (P<0.01)；20 nm PVP-AgNPs在20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1浓度下染毒HepG2细胞后微核总数均显著升高 (P<0.01)。20 nm AgNPs在80 μg·mL-1、160 μg·mL-1浓度下染毒HepG2细胞后Ⅰ型微核数显著升高(P<0.01)；20 nm PVP-AgNPs在20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1浓度下染毒HepG2细胞后Ⅰ型微核数均显著升高(P<0.01)。与阴性对照组相比，2种纳米银材料在160 μg·mL-1浓度下染毒HepG2细胞后Ⅱ型微核数均显著升高(20 nm AgNPs，P<0.05；20 nm PVP-AgNPs，P<0.01)。20 nm AgNPs在160 μg·mL-1浓度下染毒HepG2细胞后核芽数显著升高(P<0.05)；20 nm PVP-AgNPs在40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1浓度下染毒HepG2细胞后核芽数均显著升高(P<0.01)；与阴性对照组相比，2种纳米银各浓度剂量下核质桥数均无显著差异(P>0.05)。各效应指标的组间比较结果发现，除核质桥外，2种纳米银材料引起的总微核数、Ⅰ型微核数、Ⅱ型微核数、核芽数均有差异(P<0.05)，20 nm PVP-AgNPs对细胞核的影响大于20nm AgNPs。直线相关分析结果发现，20 nm AgNPs组中，除核质桥外，各效应指标均有随染毒剂量增高而增高的趋势(P<0.05，r>0.7)，20 nm PVP-AgNPs组中，除核质桥和核芽外，其他效应指标均有随染毒剂量增高而增高的趋势(P<0.05，r>0.7)，表明纳米银对HepG2细胞的遗传毒性损伤存在一定的剂量-效应关系。

表2 2种纳米银染毒HepG2细胞Olive尾矩、尾长、尾部DNA比值结果Table 2 The results of Olive tail moment, tail length and tail DNA ratio of HepG2 cells exposed to two kinds of nano silver

注：与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.01。Note：Compared with the control group,aP<0.05，bP<0.01.

3 讨论(Discussion)

在纳米银的生产和应用过程中，常用不同材料对纳米银进行表面修饰以改善其分散性和稳定性，如PVP、柠檬酸钠和多聚糖等，不同包被的纳米银可能影响与细胞的相互作用[9]。Ahamed等[10]用25 nm多聚糖包被的纳米银和未包被的纳米银以50 μg·mL-1对鼠胚胎干细胞与鼠胚胎纤维母细胞进行染毒，结果发现多聚糖包被纳米银比未包被纳米银表现出更强的细胞毒性和遗传毒性。Nguyen等[11]的研究则表明，用未包被的纳米银(20 nm、40 nm、60 nm、80 nm)染毒鼠巨噬细胞和人结肠上皮细胞比用PVP包被纳米银(10 nm、50 nm、75 nm)和柠檬酸盐包被纳米银(10 nm、50 nm、75 nm)对细胞活性的抑制作用更大。本研究结果表明，PVP包被的纳米银与无包被的纳米银引起细胞DNA损伤与染色体畸变的程度不同，这可能与2种材料的银离子释放量不同有关，因为纳米银的毒性作用可由粒子表面释放的银离子引起[12]，而纳米银的表面涂层材料影响Ag+释放[13]。

图4 胞质分裂阻滞微核细胞组学试验细胞分类注：A，双核正常细胞；B，含有Ⅰ型微核的双核细胞；C，含有Ⅱ型微核的双核细胞；D，含有核芽的双核细胞；E，含有核质桥的双核细胞。Fig. 4 The cell classification of cytokinesis micronuclear test cellsNote: A, double nucleus normal cell; B, cells containingⅠmicrokernel dual-core; C, cells containingⅡmicrokernel dual-core; D, binuclear cells containing nuclear sprouts; E, a dual-core cell containing a nuclear bridge.

表3 不同特性纳米银染毒HepG2细胞微核组学效应Table 3 Micronucleus effect of HepG2 cells exposed to nano silver with different properties

注：与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.01。Note：Compared with the blank control group,aP<0.05，bP<0.01.

本研究采用凋亡实验、彗星实验和胞质分裂阻滞微核细胞组学试验结合，从多遗传终点和遗传毒作用机制角度出发，通过分析、比较2种不同纳米银的遗传作用特征，从体外角度较全面地分析纳米银遗传毒性的剂量-效应关系。在进行彗星实验之前，对细胞样本进行“活力检查”是很常见的，最常见的试验是台盼蓝排斥试验。而彗星实验针对细胞核，而非细胞，细胞被检测方法判定死亡不一定核就不完整(例如离心造成的细胞膜破裂，而台盼蓝染料能进入膜破裂的细胞，使细胞染色)，在这种情况下细胞活力不是一个有意义的概念，且Hoechst 33258对细胞核染色清晰，不仅能测定凋亡率，而且可以清楚地观察到核形态，所以，在评价遗传毒性前，先用Hoechst 33258荧光染色法评价纳米银对HepG2细胞核形态与凋亡率的影响。

彗星实验结果表明，2种纳米银均会引起DNA损伤，这与很多研究结果类似[14-15]，如用PVP包被纳米银处理宫颈癌(Hela)、乳腺癌(MDA-MB-231和MCF-7)细胞12或24 h，彗星实验结果均显示出严重的DNA损伤[16]。同样，在本研究的胞质分裂阻滞微核细胞组学试验中，除核质桥及核芽外，2种纳米银引起的染色体畸变各效应指标均呈随染毒浓度增高而增高的趋势，表明纳米银对HepG2细胞染色体丢失、染色体断裂、基因扩增与基因量改变等遗传毒性效应呈浓度相关性。Sahu等[17]在肝癌细胞HepG2细胞和Caco细胞中，在0.5至15 μg·mL-1的浓度范围内纳米银诱导具有微核的双核细胞频率以浓度和时间依赖性的方式增加。Papageorgiou等[18]的研究表明，随着纳米银浓度的增加，MCF-7细胞和HepG2细胞的有丝分裂指数随之下降，浓度越大有丝分裂指数越小，并观察到不同类型的染色体畸变。

综上所述，纳米银对HepG2细胞可产生DNA损伤、染色体畸变等遗传毒性效应，无包被纳米银比PVP包被纳米银更容易引起DNA损伤，PVP包被纳米银比无包被纳米银更容易引起细胞染色体畸变相关效应，且损伤程度与浓度相关，浓度越高遗传损伤越严重。本研究通过彗星实验与胞质分裂阻滞微核细胞组学试验相结合探讨不同包被纳米银的体外遗传毒性差异，为纳米银的体外遗传毒性评估提供参考依据。