致蛋鸡髓细胞瘤型ALV-A病毒株的分离与鉴定

熊 瑛， 王 莹， 李长风， 梁雄燕， 杨玉莹， 顾玉芳

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州434025)

禽白血病是由禽白血病病毒引起的严重危害我国养鸡业的重要肿瘤性疾病。不同亚群的禽白血病病毒可以引起鸡淋巴细胞瘤、髓细胞瘤、血管瘤、成红细胞瘤等多种类型肿瘤发生，A、B亚群主要引起鸡经典的淋巴细胞瘤，J亚群禽白血病病毒主要引起髓细胞瘤、血管瘤为主的肿瘤[1]。过去十几年给我国养鸡业造成了巨大威胁，而其他亚群的禽白血病病毒引起病例报道较少。

近年来，随着各种外在条件的变化，禽白血病病毒不同毒株和不同亚群之间交叉重组时有发生，一些禽白血病病毒毒株的致瘤特性也发生了不同变化。最近湖北某蛋鸡场发生的一例以髓细胞瘤为主的禽白血病病例，通过病原检测和病毒分离鉴定，确诊为由A亚群禽白血病病毒引起的髓细胞瘤，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料 病鸡来源于湖北某蛋鸡养殖场，270日龄的京粉蛋鸡。无菌采集典型病变的肝组织-80 ℃冻存，备用。

1.2 试剂 rTaq酶、dNTP 等PCR相关试剂为宝生物工程(大连)有限公司产品。Multi-PCR 检测引物参照文献[2-3]及已经发表的ALV-A、ALV-B、ALV-J相关基因序列设计，用于ALV-J复检的引物H5/H7，参照文献[6]设计，均由武汉擎科创新生物技术公司合成(见表1)。肝组织DNA提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司产品。DF-1细胞由本实验室冻存，0.25%胰酶、FBS为HyClone产品，DMEM为Gbico产品，抗ALV-J的单抗JE9由扬州大学秦爱建教授惠赠，抗ALV-A的单抗AF3由本实验室自制，FITC-羊抗鼠IgG，购自武汉三鹰生物科技有限公司。

表1 用于病原检测的Multi-PCR引物

1.3 病原的Multi-PCR检测 取病鸡病变肝组织约50 mg提取DNA，方法按照试剂盒说明书进行。Multi-PCR检测ALV-A/B/J的Multi-PCR采用25 μL反应体系：10×Buffer(Mg2+Free)2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL，dNTP (2.5 mmol/L each) 2 μL，ALV-A/B/JF(10 μmol/L)2 μL，ALV-AR(10 μmol/L)0.8 μL，ALV-BR(10 μmol/L)1 μL，ALV-JR(10 μmol/L)1 μL，rTaq(5 U/μL) 0.25 μL，灭菌去离子水13.95 μL。循环条件为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。将制好的凝胶板放入电泳槽中，分别按顺序加入5 μL Marker，1 μL的Loading Buffer和5 μL的待检样品混合液，在电压95 V、电流90 mA条件下，30 min后放入凝胶成像系统中观察。

1.4 病毒的分离与鉴定 取病变肝组织，按体积比1∶5加入PBS(pH值 7.2)充分研磨，冻融3次，10 000 r/min离心10 min，取上清液经滤菌器过滤除菌即为病毒悬液。取覆盖面积约80%的DF-1细胞，弃去培养基，用PBS(pH值 7.2)洗1次，加入病毒悬液，37 ℃感作2 h，加入含1% FBS 的DMEM，培养至细胞长满。

1.5 间接免疫荧光试验(IFA) 将细胞盲传入24孔板，用含1% FBS 的DMEM营养液培养1周，待细胞长满孔底，弃上清液，再用PBS洗涤后，4%多聚甲醛固定1 h，0.5% Triton X-100透膜10 min，10% FBS封闭1 h，取3孔细胞分别加ALV-A的单抗AF3和ALV-J的单抗JE9，同时设不接毒的DF1细胞作为阴性对照组，4 ℃条件下孵育过夜，PBS洗涤后，每孔分别滴加1∶200稀释的FITC-羊抗鼠IgG，37 ℃作用1 h后，再用PBS洗涤3次，加1滴体积分数50%甘油覆盖细胞，荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 送检病鸡的病理变化 剖检病鸡眼观可见肝、肾、脾肿大，肝脏表面有大小不等的灰白色结节，镜检肝组织可见大量的髓细胞样瘤细胞增生，肝细胞变性、坏死甚至消失(见封二彩版图1) 。

2.2 Multi-PCR检测结果 以病鸡基因组DNA 为模板，扩增出与ALV-A相对应的715 bp左右的核酸条带, 未扩增出与ALV-B(515 bp)和ALV-J相对应的核酸条带(422 bp)(图2)。

图2 病鸡PCR检测结果

M:DNA Ladder DL-2 000; 1:Multi-PCR阳性对照；2：阴性对照； 3：病鸡肝组织DNA

2.3 免疫荧光反应 以ALV-A单抗AF3为一抗的病毒接毒DF-1细胞出现明显的亮绿荧光，以抗ALV-J的单抗JE9为一抗的接毒DF-1细胞及未接病毒液的细胞均无荧光(见封二彩版图3)。

3 讨论

临床上，禽白血病病例由于感染的毒株或者不同，往往呈现的病理特征也不一样。20 世纪 60 年代，世界范围内鸡群中自然发生的淋巴细胞白血病主要由 A、B亚群病毒引起[4]，其瘤细胞以原淋巴细胞为主，而且B亚群的发病率通常低于A亚群病毒的发病率。由C、D亚群病毒自然感染引起的肿瘤比较少见。20世纪的70-80年代由于欧美国家对禽白血病病毒实施有力的净化措施，几乎所有大型种鸡场已将经典的外源性 ALV-A, B, C, D 感染基本净化[5]。20世纪90年代以来新出现的J亚群禽白血病病毒亲嗜靶细胞发生了变化，不再是腔上囊B淋巴细胞，而是骨髓干细胞、血管内皮细胞以及其他细胞，以J亚群禽白血病病毒引起禽的髓细胞瘤病和血管瘤在鸡群中最为普遍。自1999年我国鸡群首次发现J亚群禽白血病以来，全国各地报道的ALV-J病例不断增多，并且呈现出宿主范围不断扩大化和肿瘤类型多样化的趋势,期间也有其他亚群的禽白血病病例发生。

本研究从一例以鸡髓细胞瘤为主的禽白血病自然病例中分离到1株A亚群禽白血病病毒。这是在自然病例中首次观察到A亚群禽白血病病毒引起蛋鸡髓细胞瘤，使得禽白血病病毒亚群的致瘤特性变得更为复杂。有研究资料说明，不同毒株所致肿瘤的类型受病毒如来源和剂量以及宿主因素如年龄、基因型和性别等有关，还与外在条件的变化等有关[6]。也有可能禽白血病病毒不同亚群毒株之间也会发生交叉重组，导致病毒发生变异，诱发不同于以往的肿瘤类型。这种现象增加了鸡群诊断和净化禽白血病的难度，需要采取更加严格的措施，对鸡群定期的、连续的抗体监测，淘汰阳性鸡，达到种鸡群净化的目的。