有机酸和糖对野生樱桃李花色苷的辅色作用

李紫薇， 刘 伟， 欧阳艳， 徐维义

(伊犁师范学院化学与环境科学学院，新疆伊宁 835000)

花色苷作为一种天然食用色素，资源丰富、安全，而且具有一定的营养和药理作用，但其很容易变色，稳定性受到很多因素影响，如酸碱度变化、氧化剂、酶、金属离子、温度和光照等，在一定程度上限制了其广泛应用。野生樱桃李(PrunusdivaricataEhrh.)系蔷薇科李属落叶灌木或小乔木，是世界上极为珍贵并且濒临灭绝的原始野生林果[1-4]。野生樱桃李成熟果实的颜色可分为紫、红、黄3大类型。紫果的色价较高，含有矢车菊3-半乳糖苷、矢车菊3-葡萄糖苷、矢车菊 3- 芸香糖苷、矢车菊(乙酰基)3-葡萄糖苷[5]。目前已有关于野生樱桃李紫果色素的提取、稳定性和抗氧化活性[6-8]等研究，但对野生樱桃李花色苷的辅色作用研究未见报道。

本研究选取7种有机酸(草酸、丙二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、丁二酸、甘氨酸)和3种糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)，研究其在邻苯二甲酸氢钾(KHP)缓冲溶液体系(pH值=3、4)和醋酸-醋酸钠(HAc-NaAc)缓冲溶液体系(pH值=4)中对野生樱桃李花色苷的辅色作用，旨在为野生樱桃李色素在食品加工中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野生樱桃李于2016年9月初采自新疆伊犁霍城县大西沟，洗净、剥皮，果皮烘干后粉碎，过60目筛备用。D101大孔树脂，购自郑州勤实科技有限公司；无水乙醇、氯化钾、盐酸、无水乙酸钠、丁二酸、甘氨酸、草酸、丙二酸、DL-苹果酸、柠檬酸、酒石酸、邻苯二甲酸氢钾、葡萄糖、果糖、蔗糖和亚硝酸钠，均为分析纯。实验用水为去离子水。

UV-3900紫外可见分光光度计，日本日立高技术公司生产；723PC可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司生产；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂生产；TD25-WS多管架自动离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司生产；XH-2008D型电脑智能温控超声波合成萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司生产；PHSJ-5 pH计，上海精密科学仪器有限公司生产；FA2104N电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 野生樱桃李花色苷的制备 以盐酸-乙醇溶液(盐酸浓度为0.1 mol/L，乙醇体积分数为50%)为提取剂，提取野生樱桃李紫果皮中花色苷，料液比为1 g ∶25 mL，超声波功率为 250 W，浸提15 min。抽滤后收集滤液，将滤液在0 ℃左右低温冷置6 h，离心(4 000 r/min，15 min)，收集上清液，于50 ℃减压浓缩。粗提物过D101大孔树脂柱，以体积分数80%乙醇为洗脱剂，将所得洗脱液于50 ℃以下减压浓缩，浓缩液经冷冻干燥后得暗紫红色花色苷提取物[6]。

1.2.2 花色苷含量的测定 本试验采用pH值示差法测定野生樱桃李花色苷含量[9-11]，参考宋德群等对蓝莓花色苷含量测定用的pH值示差法中缓冲液配制方法[12]。具体花色苷含量计算公式如下：

(1)

ΔD=(D520 nm，pH值1.0-D700 nm，pH值1.0)-(D520 nm，pH值4.5-D700 nm，pH值4.5)。

(2)

式中：D为吸光度；ε为矢车菊-3-葡萄糖苷的消光系数(26 900)；n为稀释倍数；M为矢车菊-3-葡萄糖苷的分子量(449.2)；V为溶液体积，mL；m为纯化后的花色苷粉末质量，g；L为光程(1 cm)。此外，以缓冲溶液作参比，用D700 nm来消除样液混浊的影响。

1.2.3 不同缓冲溶液体系中有机酸对野生樱桃李花色苷的辅色效果 以KHP缓冲溶液(pH值=3.0)为溶剂，分别配制 0.200 mol/L 草酸、丙二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、丁二酸、甘氨酸7种有机酸储备液。取1 mL花色苷溶液于10 mL容量瓶中，加入一定体积0.200 mol/L有机酸作为辅色剂，用KHP缓冲溶液定容至10 mL，研究不同浓度各有机酸对野生樱桃李花色苷的辅色效果。各有机酸系列浓度分别为0、1.0×10-2、3.0×10-2、5.0×10-2、7.0×10-2、9.0×10-2、1.0×10-1mol/L，花色苷浓度为4.3×10-3mol/L(以矢车 菊-3-葡萄糖苷计)，将有机酸-花色苷混合溶液静置2 h，以缓冲溶液为参比，于520 nm处测吸光度。参考顾林等的计算方法[13-14]，有机酸对野生樱桃李花色苷的辅色效果以/mol有机酸引起的野生樱桃李花色苷吸光度增加量，即用辅色度(I)表示：

(3)

式中：D520 nm(0)、D520 nm分别为加入有机酸前、后野生樱桃李花色苷溶液的吸光度；C为有机酸浓度(mol/L)。

有机酸浓度为0.09 mol/L，花色苷浓度为4.3×10-3mol/L，将各有机酸与花色苷的混合溶液(pH值=3.0)分别置于15、20、25、35、45、55、65 ℃恒温水浴2 h，以pH值=3.0的KHP缓冲溶液为参比测吸光度，重复3次。

参照上述方法，分别考察各有机酸在KHP缓冲溶液体系(pH值=4)和HAc-NaAc缓冲溶液体系(pH值=4)中对花色苷的辅色效果。

1.2.4 不同缓冲溶液体系中糖对野生樱桃李花色苷的辅色效果 以KHP缓冲溶液(pH值=3.0)为溶剂，分别配制 0.200 mol/L 葡萄糖、蔗糖、果糖储备液。吸取1 mL花色苷溶液7份，加入0.200 mol/L葡萄糖作为辅色剂，缓冲溶液稀释并定容至10 mL，使花色苷浓度为4.3×10-3mol/L，各糖系列浓度分别为0.0、1.0×10-2、3.0×10-2、5.0×10-2、7.0×10-2、9.0×10-2、1.0×10-1mol/L。将花色苷-糖溶液静置2 h，以缓冲溶液为参比，于520 nm处测吸光度，重复3次，研究不同浓度葡萄糖对野生樱桃李花色苷的辅色效果。将 4.3×10-3mol/L花色苷和0.09 mol/L糖混合溶液分别置于15、20、25、35、45、55、65 ℃恒温水浴锅中，恒温2 h后测其吸光度。以缓冲溶液为参比，测定波长为520 nm，并与未辅色的花色苷溶液对照试验，重复3次，考察温度对辅色效果的影响。参照上述方法，分别考察葡萄糖、蔗糖、果糖在KHP缓冲溶液体系(pH值=4)和HAc-NaAc缓冲溶液体系(pH值=4)中对花色苷的辅色效果以及温度对辅色效果的影响。

1.2.5 糖与亚硝酸钠共存时的辅色效果 设花色苷浓度为 4.3×10-3mol/L，亚硝酸钠浓度分别是0.0、1.0×10-2、3.0×10-2、5.0×10-2、7.0×10-2、9.0×10-2、1.0×10-1mol/L，野生樱桃李花色苷溶液与亚硝酸钠溶液一经混合即刻测定吸光度，比较不同浓度亚硝酸钠在3种缓冲溶液体系中对花色苷的氧化降解作用。在KHP缓冲溶液体系(pH值=3)中，蔗糖、果糖、葡萄糖浓度为0.09 mol/L，考察糖与亚硝酸钠共存时对花色苷的辅色效果，测定波长为 520 nm，绘制动力学曲线，重复3次。

2 结果与分析

2.1 花色苷含量的测定

准确称取0.050 0 g制备的花色苷粉末，用KHP缓冲溶液(pH值=3)溶解并定容至100 mL。移取5 mL该色素溶液于50 mL容量瓶中，平行2份，分别用氯化钾-盐酸(pH值=1.0)和醋酸钠-盐酸的缓冲溶液(pH值=4.5)稀释定容，静置2 h后在520、700 nm处测吸光度。本试验采用pH值示差法测定花色苷含量，根据公式(1)和公式(2)，测得野生樱桃李花色苷的含量为38.27 mg/g。

2.2 有机酸对野生樱桃李花色苷的辅色作用

2.2.1 不同pH值的缓冲溶液中有机酸的辅色效果 本试验考察了草酸、丙二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、丁二酸和甘氨酸在3种缓冲体系中对野生樱桃李花色苷的辅色效果。由图1可知，在研究的7种有机酸中，除甘氨酸外，其他6种有机酸在考察的浓度范围内具有辅色作用，其原因可能是几种有机酸与野生樱桃李花色苷形成了氢键，从而产生了辅色和稳定作用。有机酸的浓度为0.01～0.03 mol/L时，对野生樱桃李花色苷的辅色度最大，有机酸浓度为0.03 mol/L时，在KHP缓冲溶液体系(pH值=3)中有机酸辅色度相对大小排列是草酸>丙二酸>柠檬酸、酒石酸、丁二酸>苹果酸、甘氨酸；在KHP缓冲溶液体系(pH值=4)中有机酸辅色度相对大小排序是草酸>柠檬酸>丙二酸>酒石酸>苹果酸>丁二酸>甘氨酸；在HAc-NaAc缓冲体系(pH值=4)中有机酸辅色度相对大小排序是：草酸>丙二酸>酒石酸、柠檬酸>苹果酸>丁二酸>甘氨酸。综上可以看出，在研究的7种有机酸中，草酸的辅色作用最强，甘氨酸的辅色作用最弱。pH值为3时，野生樱桃李花色苷溶液较pH值为4时的颜色深，有机酸在pH值=4的2种缓冲溶液中的辅色度明显大于在pH 值=3的KHP缓冲体系中的辅色度。由于花色苷在pH值=3的缓冲溶液体系中吸光度最大最稳定，故后续选取pH值=3的KHP缓冲体系进行试验。

2.2.2 不同温度有机酸的辅色作用 在KHP缓冲体系(pH值=3)中，考察了0.09 mol/L有机酸在不同温度下对野生樱桃李花色苷的辅色效果。在考察的温度范围内，野生樱桃李花色苷经草酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、 丁二酸辅色处理后的热稳定性有不同程度的提高，其中草酸、丙二酸、柠檬酸、酒石酸对花色苷的热稳定性影响最大。

2.3 葡萄糖、果糖、蔗糖对花色苷的辅色作用

2.3.1 不同pH值缓冲溶液中糖对花色苷的辅色效果 如图2所示，室温条件下，在考察的浓度范围内，葡萄糖、果糖、蔗糖对野生樱桃李花色苷的辅色作用不明显。

2.3.2 不同温度下糖对花色苷的辅色作用 在不同温度条件下，本试验考察了0.09 mol/L葡萄糖、果糖、蔗糖对花色苷的辅色效果。如图3所示，野生樱桃李花色苷的降解速度随着温度的升高而加快。葡萄糖、果糖、蔗糖的存在对野生樱桃李花色苷的热稳定性是不利的。有研究表明，果糖较葡萄糖和蔗糖会更容易地转化为糠醛类物质，降解效果比葡萄糖、蔗糖要大一些，但是由于每种植物所含花色苷组分和成分背景不同，稳定性也不同[15]。在本试验体系中，葡萄糖和果糖对野生樱桃李花色苷的降解作用无明显差异，且这2种糖对花色苷的促降解作用大于蔗糖。温度大于35 ℃时，葡萄糖、果糖对花色苷的促降解作用较低温时明显。蔗糖在温度大于55 ℃时，表现出对花色苷的轻微护色作用。

2.3.3 糖与亚硝酸钠共存时的辅色作用 葡萄糖、果糖、蔗糖虽然对花色苷没有明显的辅色作用，但根据相关报道，葡萄糖和蔗糖能够提高花色苷的稳定性。本试验进一步考察了糖在与亚硝酸钠共存时，对野生樱桃李花色苷的辅色作用。如图4所示，亚硝酸钠浓度越大，对花色苷的降解作用越明显。

在KHP缓冲体系(pH值=3.0)中，0.09 mol/L糖与 0.18 mmol/L 亚硝酸钠混合溶液在3 h后褪至无色。由图5可知，葡萄糖、果糖和蔗糖在一定程度上能够提高野生樱桃花色苷的抗氧化作用，蔗糖的作用尤为明显。这可能是由于糖类降低了水活度，水活度的降低会相应地导致花色苷的降解反应速率下降，当水成为一种限制因素时，花色苷发色团就不易水化生成无色化合物。

3 结论与讨论

本研究比较了7种有机酸和3种糖在KHP缓冲体系(pH值=3、4) 和HAc-NaAc缓冲体系(pH值=4)中对野生樱桃李花色苷的辅色作用。有机酸在pH值=4的2种缓冲溶液中的辅色度明显大于在pH值=3的KHP缓冲体系中的辅色度。在研究的7种有机酸中除甘氨酸外，草酸、丙二酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸和丁二酸在考察的浓度范围内都具有辅色作用，有机酸浓度在0.01～0.03 mol/L范围内对野生樱桃李花色苷的辅色度最大，其中草酸的辅色作用最强，甘氨酸具有减色作用。野生樱桃李花色苷经草酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、丁二酸辅色处理后的热稳定性有不同程度的提高。葡萄糖、果糖、蔗糖对野生樱桃李花色苷的辅色作用不明显。在与氧化剂亚硝酸钠共存条件下，蔗糖明显表现出抑制亚硝酸钠对花色苷的氧化降解作用。

天然色素富含丰富的营养物质，对人体无毒副作用，具有一定的保健功能，作为着色剂，也有良好的着色效果。但在应用过程中，天然色素稳定性受到很多因素的影响。本试验初步讨论了7种有机酸和3种糖对野生樱桃李色素的辅色作用，研究结果为野生樱桃李色素的开发利用提供了参考依据。