马铃薯枯萎病拮抗菌的筛选与鉴定

李彩虹， 杨志辉， 张 岱， 赵冬梅， 潘 阳， 朱杰华

(河北农业大学植物保护学院，河北保定 071000)

马铃薯枯萎病是由茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、雪腐镰刀菌、接骨镰刀菌5种不同的镰刀菌寄生所引起的一种真菌土传病害[1]，分布广泛，在我国各种植区均有发生，发病率达15%～45%[2]。近年来，随着马铃薯主粮化战略的实施，马铃薯种植面积逐年扩大，由此带来的连作重茬导致马铃薯枯萎病日益加重，一般造成减产30%，严重时可造成78%的植株死亡，直接影响了马铃薯产量及其经济效益，严重制约了我国马铃薯产业的发展[2-3]。

目前，马铃薯枯萎病的防治措施主要以农业防治和化学药剂拌种为主，但由于该病为土传病害，其病原菌抗逆性强且对植株为系统性侵染，使用药剂防治效果较差，使用药剂进行大面积的土壤处理可行性较小[3]。在缺乏有效化学药剂和抗病品种的前提下，利用拮抗菌防治枯萎病是防治途径之一，并且生防菌对环境、生态和人类健康安全，具有改善环境、获得长期效益作用，符合现阶段植物病害控制的发展方向[4]。

芽孢杆菌可以形成耐高温、辐射、高酸碱等逆境的芽孢，能够产生脂肽类和蛋白类等抗真菌物质，具有广谱抗真菌活性和良好的稳定性，越来越为人们所关注。普遍认为芽孢杆菌生防机制主要有营养和空间位点竞争、抗菌物质产生、溶菌作用、诱导植物抗病性等[5]。目前，利用芽孢杆菌有益菌株拮抗植物镰刀菌病害的研究已有较多报道，如黄瓜枯萎病[6]、香蕉枯萎病[7]、西瓜枯萎病[8]以及马铃薯干腐病[9]等，但针对马铃薯枯萎病开展的拮抗芽孢杆菌筛选的研究尚不多见，因此，进一步筛选出适合我国不同区域的芽孢杆菌菌株对于防治马铃薯枯萎病具有重要意义。

本研究从16个马铃薯枯萎病发生地块的健康植株根际分离筛选出6株对马铃薯枯萎病病原菌有极强抗性的芽孢杆菌菌株，并对其中NZ-4菌株的抑菌谱进行了测定，旨在为马铃薯枯萎病的生物防治以及生防菌剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 土样采集

从河北省保定、承德、张家口、秦皇岛以及内蒙古自治区、贵州省的马铃薯枯萎病发病田块中采集健康植株的根际土壤，采集深度范围为10～20 cm，用无菌自封袋封好后带回实验室，暂保存于4 ℃，用于分离拮抗菌。

1.2 靶标病原菌

1株尖镰孢马铃薯专化型菌株(Fusariumoxysporumf.sp. tuberosi，Y10-2)，由河北农业大学植物病理学实验室提供。

1.3 培养基

细菌为LB培养基[10]，真菌为PDA培养基[11]。

1.4 芽孢杆菌菌株的分离和纯化

采用热处理土壤稀释法[12]分离芽孢杆菌，连续划线培养至纯，以体积比1 ∶1混合于70%甘油中，-80 ℃冰箱保存备用。

1.5 拮抗菌的筛选

采用平板对峙法[13]测定芽孢杆菌对尖孢镰刀菌Y10-2的拮抗作用。初筛采用抑菌带法，将接种平皿置于25 ℃恒温培养箱内培养，以只接种病原菌的PDA平板为对照，待对照长满平皿时，测量抑菌带宽度并筛选出抑菌效果较好的菌株，采用抑菌圈法进行复筛试验。

1.6 拮抗菌株的鉴定

采用菌落形态、革兰氏染色与分子生物学相结合的方法对筛选到的拮抗菌株进行鉴定。

gyrB基因的序列分析：正向引物gyrB-F为5′-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3′；反向引物gyrB-R为5′-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3′[14]。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 终止反应。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳上检测后，送生工生物工程(上海)有限公司进行测序。将所测序列通过NCBI数据库进行BLAST比对，利用Clustalx和MEGA 6.0[15]软件对分离芽孢杆菌及模式菌进行系统发育分析。

1.7 拮抗菌抑菌谱测定

采用对峙培养法测定拮抗菌株对马铃薯炭疽病、马铃薯疮痂病、小麦根腐病菌、梨黑斑病菌、苹果斑点落叶病菌、番茄早疫病菌、红腐病菌以及烟草疫霉菌等重要的农业病害病原真菌的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌的分离及拮抗菌株的筛选

从16份根际土壤中分离纯化到对马铃薯枯萎病菌具有潜在拮抗作用的芽孢杆菌有288株。通过平板对峙法初筛获得抑菌带宽度≥3 mm的拮抗菌株188株，占所有菌株的 65.3%。其中，20株拮抗菌抑菌带宽度达到5.7 mm以上。利用抑菌圈法继续对20株拮抗菌进行复筛，获得抑菌圈直径>20.0 mm的拮抗菌6株(表1、图1)。

2.2 芽孢杆菌的种类鉴定

2.2.1 形态学特征 拮抗菌菌落呈圆形、乳白色，菌落边缘不整齐、表面有突起或褶皱，具有一定的粘附性，直径为5 mm左右；4 d后可产生棕褐色色素。6株拮抗菌根据其菌落形态具体又可分为3类：NZ-4菌株为第1类，菌落中间为突起状，边缘褶皱明显，颜色较暗；NZ-5、NZ-6、HC-Z-18为第2类，菌落中间突起部分有凹陷，似喷泉状，边缘较为整齐；HC-Y-5、HC-Y-16为第3类，菌落中间凹陷，似鱼嘴状，边缘褶皱明显，不整齐。6株拮抗菌菌体均为杆状，长约 2 μm，单生，革兰氏染色结果为阳性(图2)。

表1 芽孢杆菌对尖孢镰刀菌的抑制作用

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。表2同。

2.2.2 拮抗菌gyrB基因序列分析 测定了NZ-4等6个芽孢杆菌菌株的gyrB基因序列，其序列相同，为1个haplotype，长度为964～999 bp。将该序列在GenBank数据库中进行Blast，并下载相似性高于98%的序列8条。以Bacillussubtilis(枯草芽孢杆菌)等为外群，同源序列比对后，获得长度为 892 bp 的gyrB基因数据组，利用邻接法构建了6个未知芽孢杆菌的系统发育树(图3)。该树形成1个大分支，即解淀粉芽孢杆菌复合种，该大分支可分为3个末端分支，从上到下分别为Bacillusvelezensis、Bacillusamyloliquefaciens和解淀粉芽孢杆菌中的另外1个隐藏种。本研究中的6条序列均聚在第1个分支，将其鉴定为Bacillusvelezensis。

2.3 拮抗菌NZ-4的抑菌谱

将菌株NZ-4对8株病原菌株进行抑菌谱测定。结果显示，菌株NZ-4对马铃薯炭疽病、疮痂病的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到35 mm； 对小麦根腐病菌、梨黑斑病菌、苹果斑点落叶病菌、番茄早疫病菌的抑菌圈直径均在24 mm以上；对红腐病菌也有一定的拮抗作用；但对烟草疫霉菌的拮抗作用不明显(表2、图4)。表明菌株NZ-4有比较广的抑菌谱，可以考虑将其应用于除马铃薯枯萎病外的其他作物病害的生防研究。

3 讨论

采用gyrB序列对比方法对NZ-4等6株芽孢杆菌菌株进行了系统发育分析，并结合传统的形态观察将它们鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。系统发育分析主要依据与6株拮抗菌gryB基因序列同源性为99%的 DQ903176(GenBank登录号)，该菌株同KY315726、KM603514和KR605463单独聚为1个分支。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是2005年由Ruiz-García等新命名的芽孢杆菌种[16]，DQ903176菌株属于Bacillusvelezensis，该菌之前被认定为Bacillusamyloliquefaciens的后异形同义词[17]，2015年，Dunlap等通过对BacillusvelezensisNRRL B-41580T进行比较基因组学和DNA-DNA杂交分析，否定了Bacillusvelezensis为Bacillusamyloliquefaciens的后异形同义词，即Bacillusvelezensis为不同于Bacillusamyloliquefaciens的一个种[18]。因此，本研究将登录号为DQ903176的菌株所在的分支界定为Bacillusvelezensis种群，并将6株拮抗菌鉴定为Bacillusvelezensis。

表2 拮抗菌株NZ-4对不同病原菌拮抗效果

贝莱斯芽孢杆菌是一种新型生防细菌，有关它的研究日益增多。有研究发现，该菌对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌[19]、番茄灰霉病灰葡萄孢菌[20]等具有拮抗活性，该菌产生的β-葡聚糖酶可抑制杨树紫纹羽病菌[21]，还有研究者将该菌制成生物制剂，可有效降低赤霉病和DON积累[22]。本研究从16个马铃薯种植地块分离筛选得到6株贝莱斯芽孢杆菌，它们对马铃薯枯萎病病原菌尖孢镰刀菌都具有很强的拮抗活性，为贝莱斯芽孢杆菌在马铃薯枯萎病的生物防治上提供了新的科学依据。

芽孢杆菌的拮抗机制通常是由于它能产生生物活性物质[23-24]。芽孢杆菌产生的拮抗物质主要有细菌素、抗生素、细胞壁溶解酶、其他抑菌蛋白及挥发性抗菌物质等[25]。相关研究表明，芽孢杆菌产生的fengycin类和iturin类家族的脂肽类化合物在抑制真菌病害中起着重要作用，这些物质中的一些只抗相同或相近的有特异受体位点的种类[26]。Lee等研究发现，贝莱斯芽孢杆菌产生的bacillomycin D、fengycin和(oxy) difficidin等活性物质抑制病原菌[27]。本研究结果表明，NZ-4菌株对除马铃薯枯萎病以外的其他多种重要农业病害病原菌也能产生较强的拮抗作用，由此推测，NZ-4菌株可能产生多种不同的抑菌物质，亦或该菌株产生的抑菌物质有较广的抑菌能力，具体活性物质成份还有待于进一步研究，以期为该菌株在生产实践中更广泛的应用提供理论基础。