乳腺癌淋巴微转移模型的建立及皮内与静脉注射18F-脱氧葡萄糖的诊断效果

李永霞，郑营营，孙玉云，何思敏,4，罗建民，张建平,4，曹天野,4，王明伟,4，章英剑,4

1.复旦大学附属肿瘤医院核医学科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032；

2.复旦大学生物医学影像研究中心，上海200032；

3.上海市质子重离子医院核医学科，上海201315；

4.上海分子影像探针工程技术研究中心，上海200032

［关键字］ 乳腺癌；淋巴结微转移；皮内注射；静脉注射；18F-脱氧葡萄糖PET/CT成像

静脉注射18F-脱氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG）后的代谢显像已广泛用于恶性肿瘤分期和疗效评价［1］，包括用于乳腺癌腋窝淋巴结和内乳淋巴结转移的诊断［2-4］。近年来有研究者采用手持型高能γ探测器，用于18F-FDG静脉注射后术中指导乳腺癌病灶清除［5］，还有研究者采用局部皮内注射18F-FDG进行小鼠前哨淋巴结显像［6］，提出“正电子淋巴结显像”（positron lymphography）的概念。本研究构建乳腺癌淋巴微转移小鼠模型，比较区域性皮内与静脉注射18F-FDG后小鼠PET/CT成像，以评估不同注射方式下18F-FDG PET/CT对乳腺癌淋巴结微转移成像的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和动物

4T1乳腺癌肿瘤细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库。SPF级8周龄BALB/c雌性裸鼠6只，体质量20～25 g，购于复旦大学上海医学院实验动物部，显像前2周于实验中心饲养。

1.1.2 试剂和仪器

18F-FDG和99mTc-SC由本科室自制。DMEM培养基购自Gibco公司。小动物PET/CT（型号Inveon，购自德国Siemens公司）、小动物SPECT/CT（型号Bioscan，匈牙利Mediso公司）均为本科室拥有。

1.1.3 细胞培养及肿瘤淋巴微转移动物模型的建立

细胞培养主要参考美国模式培养物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）提供的方法。4T1细胞用DMEM培养基，于37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中常规培养，每3～4 d在细胞对数生长期时按1∶3传代培养。以无血清DMEM培养基洗涤，调整活细胞密度为1×106个/mL，制成细胞悬浊液，分别在6只雌性裸鼠右侧第二乳房脂肪垫内注射0.1 mL。成瘤3 d后，手术取出部分瘤，术后第11天成像。有创伤操作均在洁净麻醉下进行。小鼠饲养于标准动物房。

1.2 研究方法

1.2.1 荷瘤小鼠淋巴结PET/CT和SPECT/CT显像

严格遵守《实验动物科学与管理》，所有操作过程均于麻醉（1%～2%异氟烷与空气混合物）状态下进行。每次18F-FDG成像前禁食4 h，先在左、右前爪皮内分别等量注射3.7 MBq18F-FDG，总剂量为7.4 MBq，1 h后小动物PET/CT显像；24 h后尾静脉注射7.4 MBq18F-FDG，再次显像。PET/CT显像按三维模式采集10 min静态图像，并采用OSEM3D/MAP法重建，获得衰减校正后的PET/CT融合图像。然后在疑似有淋巴结微转移的荷瘤鼠左、右两侧前爪皮内分别注射3.7 MBq锝硫胶体（technetium sulfur colloid，99mTc-SC），1 h后进行SPECT/CT静态显像，并测量瘤周淋巴结和对侧淋巴结放射性占注入量的百分比（%ID/g）。

显像后处死裸鼠，摘取肿瘤组织、瘤周淋巴结和对侧淋巴结标本，用10%中性甲醛溶液固定。

1.2.2 病理学分析

荷瘤裸鼠肿瘤组织经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规脱水，透明，浸蜡，切片厚5 μm，行H-E染色。用SAB法分别检测肿瘤组织、瘤周转移淋巴结、对侧阴性淋巴结中上皮细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）和葡萄糖转运蛋白1（Glut-1）的水平。

1.2.3 统计学处理

采用Image-Pro Plus 6.0分析阳性细胞率，SPSS 19.0软件进行统计分析，计量数据以x±s表示，单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 18F-FDG不同注射方式下荷瘤小鼠PET/CT成像差异

前爪皮内注射18F-FDG后，有2只小鼠瘤周腋下淋巴结摄取值异常增高，ID%/g值为19.2±2.0，明显高于对侧淋巴结（ID%/g为6.8±0.4）及其他4只小鼠相同位置淋巴结（ID%/g为7.2±0.4）（P＜0.001；图1A）。静脉注射时，所有小鼠瘤周腋下淋巴结几乎与背景相当（图1B），ID%/g值为2.5±0.5。

此外，瘤周淋巴结摄取较高的荷瘤小鼠前爪皮内注射传统淋巴结显像剂99mTc-SC后1 h，可观测到细长淋巴引流区域，两侧出现4个放射性摄取增高淋巴结，ID%/g值约为0.32±0.3，差异无统计学意义（P=0.415）。瘤周侧的一个淋巴结与18F-FDG高摄取淋巴结位置相吻合。

2.2 4T1乳腺癌淋巴结微转移的免疫组织化学结果

图1 不同注射方式下的PET和SPECT成像图及摄取值A：同一只荷瘤小鼠，前爪皮内注射；B：尾部静脉注射18F-FDG后1 h的肿瘤PET/CT成像剖面图（n=3）；C：前爪皮内注射淋巴显像剂99mTc-SC后1 h SPECT/CT成像的肿瘤最大密度投影图和剖面图（n=3）

解剖后发现，皮内注射18F-FDG摄取较高的小鼠（2/6）瘤周淋巴结为红色稍大淋巴结（图2），CK5/6呈强阳性，阳性率为（73.9±7.1）%。HE染色显示淋巴结结构未发生破坏，证明其为微转移淋巴结［7］。定量分析18F-FDG摄取较低小鼠（4/6）的瘤周淋巴结，CK5/6阳性率为（10.1±4.7）%（P＜0.000 2）。此外，阳性转移淋巴结中Glut-1阳性率为（51.9 ±11.5）%，明显高于阴性淋巴结的（15.2±1.3）%（P＜0.01）。

图2 组织病例特性鉴定A：肿瘤组织、阳性转移淋巴结和阴性淋巴结的H-E染色及免疫组织化学染色（×200）；B～C：不同组织中CK5/6（B）和Glut-1（C）的阳性表达率

3 讨 论

前哨淋巴结活检较多用于乳腺癌、黑色素瘤及子宫颈癌等的淋巴结分期、预后分析和决定是否进行淋巴结清扫［8］。该方法通常使用染料和（或）放射性药物99mTc-SC在瘤周皮内局部注射以定位前哨淋巴结，然后通过病理分析观察其是否有转移，如有转移则进一步开展淋巴结清扫［9-11］。因此，这类“淋巴结显像术”仅适用于前哨淋巴结定位，不能定性。虽然其定位准确率达94%［12］，但识别淋巴结是否转移或微转移有赖于病理学检查结果。此外，注射过量或注射压力不当会使区域淋巴结过量显示，难以决定前哨淋巴结数量［13］。静脉注射18F-FDG后全身PET/CT显像，可发现较大的转移性淋巴结，这些宏转移淋巴结中通常葡萄糖代谢增高；而静脉注射18F-FDG使放射性呈全身分布，微转移淋巴结常因放射性摄入不足而难以显示。

Thorek等［6］首次提出“正电子淋巴显像”，证实可通过皮内注射18F-FDG定位正常小鼠淋巴结位置，1 h后淋巴结ID%/g值为2～8，与本研究阴性淋巴结的ID%/g值（7.2±0.4）相当。转移淋巴结高摄取的原因，可能主要是局部注射后经淋巴管进入淋巴结的放射性浓度远高于静脉注射法，从而容易显示肿瘤细胞数量不多但葡萄糖代谢增高的微转移，这一点与转移淋巴结和阴性淋巴结的Glut-1阳性率相吻合。

本研究建立的乳腺癌淋巴结微转移模型证实，局部注射18F-FDG比静脉注射能更好地显示淋巴结转移，原位接种再手术去除部分瘤体的方法可促使淋巴结微转移。淋巴结CK5/6结果证实转移率约为33%（2/6），与局部皮内注射18F-FDG成像判断的淋巴结转移率一致。值得一提的是，只有阳性淋巴结有较高的18F-FDG摄取，其余瘤周阴性淋巴结则不然。目前，国外正在进行多项临床试验，以验证不同注射方式（瘤内、间质注射等）下的“正电子淋巴显像”效果（临床试验编号：NCT02285192），其结果将于近几年公布。此外，“正电子淋巴显像”可结合“切伦科夫成像”帮助术中清扫淋巴结［6］，但临床上可能会遇到一些问题，如人体成像相对于动物实验需更长采集时间，人体组织也可能对切伦科夫信号有干扰。因此，“正电子淋巴显像”的临床应用尚需时日。

综上所述，本研究构建了小鼠乳腺癌淋巴结微转移模型，对比不同注射方式（局部皮内与静脉注射）及不同显像剂（18F-FDG与99mTc-SC）时瘤周淋巴结成像，发现皮内注射18F-FDG能更好地实现术前诊断乳腺癌淋巴结微转移。