5个产地菘蓝种子萌发及幼苗生长对盐胁迫的响应

王雨,周睿颖,马立敏,白钰,关佳莉,唐晓清

(南京农业大学，中药研究所，江苏 南京 210095)

盐渍化土壤已成为制约农业生产及发展的全球性问题[1]。我国盐碱地面积大、分布范围广，不当的灌溉方式及化肥的过度施用则进一步加剧了土壤的次生盐渍化[2]。植物不同生长时期的耐盐性有所差异，而种子萌发期是植物生长初期比较脆弱的阶段，也是盐胁迫的敏感期，并决定着植物后期的生长、产量和品质[3]。盐胁迫会对种子萌发产生渗透胁迫和离子毒害，从而导致植物种子萌发受阻，生长发育迟缓，产量下降[4]。种子萌发过程中对这两种效应的综合适应则决定了种子耐盐性，而温度及盐分种类等因素通过协调渗透胁迫及离子效应，最终影响种子的耐盐能力[5]。盐胁迫下，渗透胁迫使得棉籽种子吸水困难，发芽率下降[6]。在对盐生植物盐爪爪(Kalidiumfoliatum)和盐穗木(Halostachyscaspica)的盐分及水分胁迫研究中发现，渗透胁迫是抑制盐生植物种子萌发的主要原因[7]。张万钧等[8]研究了等渗PEG和NaCl对盐生植物及非盐生植物种子萌发的影响，发现种子萌发可能与渗透胁迫、内部的盐离子及相关酶活性的变化均相关。此外，植物不同种源间的遗传差异也是影响其耐盐性的重要因素之一。

植物在遭受胁迫时，其形态、生长、生理等方面会发生一系列变化以应对环境的改变。菘蓝(Isatisindigotica)为十字花科(Cruciferae)二年生草本植物，其干燥叶入药为中药大青叶，具有凉血消斑、泻火定惊等功效；其干燥根入药为板蓝根，在抗流感病毒方面具有显著功效[9-10]。王竹承等[11]研究发现，土壤干旱明显抑制菘蓝生长，长时间的干旱胁迫会导致菘蓝体内可溶性蛋白质、类胡萝卜素含量的升高。而淹水条件下，菘蓝根系内的乙醇脱氢酶活性增强，从而有效缓解淹水胁迫造成的伤害[12]。潘晓红等[13]的研究表明，盐胁迫下，外源褪黑素能够显著降低盐菘蓝种子的膜质过氧化水平，提高抗氧化活性。作为常用大宗药材大青叶及板蓝根的基原植物，菘蓝在全国种植范围广、面积大，其中不乏盐碱地，土壤盐渍化威胁着菘蓝的种植和生产。目前对于菘蓝的研究多集中于药理及药化方面[14-15]，关于逆境胁迫对其生理生化方面的研究较少，而针对其耐盐机理的研究则是鲜见报道。因此，本研究以来自河北保定、内蒙古包头、辽宁铁岭、安徽亳州、山东滨州5个产地的菘蓝为对象，探究盐胁迫下菘蓝种子萌发及幼苗生长、生理特性的变化规律，综合评价其耐盐性，以为菘蓝抗盐材料的筛选及耐盐性生理研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2015年6月开始，试验材料为分别来自河北保定(Baoding,Hebei,HB)、山东滨州(Binzhou,Shandong,SB)、安徽亳州(Bozhou,Anhui,AH)、内蒙古包头(Baotou,Inner Mongolia,NB)、辽宁铁岭(Tieling,Liaoning,LT)5个产地的菘蓝种子(角果，生产中称种子)，由河北安国鑫城种业于原产区菘蓝生产基地收集，经南京农业大学园艺学院王康才教授鉴定为十字花科菘蓝(I.indigotica)。

1.2 试验方法

1.2.1种子耐盐性试验 挑选饱满、大小一致的菘蓝种子，用10.0% NaClO对菘蓝种子消毒10 min，后用蒸馏水冲洗3～5次，用滤纸吸干种子表面水分，置于培养皿中培养。培养皿中平铺2层滤纸，分别以0、50、100、150 mmol·L-1的NaCl溶液浇透培养皿底部，每皿加入相应浓度的盐溶液15 mL，再覆盖浸透处理液的滤纸。每个处理共设4个重复，每个重复50粒种子。将培养皿置于光照培养箱中培养10 d，第4天统计发芽势，7 d后发芽结束。培养条件为：光照时间18 h/6 h(光/暗)，光照度10000 lx，温度25 ℃/15 ℃(昼/夜)。培养过程中每2 d换一次滤纸及相应的处理液，以维持盐溶液浓度的恒定。

1.2.2幼苗耐盐性试验 菘蓝种子经10% NaClO消毒后，播种于塑料盆(盆高20 cm，口径26 cm，底径18 cm)中，栽培基质为蛭石∶有机质=1∶1，自然采光避雨栽培。用1/2氮浓度的Hoagland营养液浇灌培养幼苗至四叶期，每盆定苗10株并开始处理，分别浇施0、50、100、150 mmol·L-1NaCl处理液，并以0 mmol·L-1NaCl处理为对照(CK)，每个处理3次重复，每个重复3盆苗，处理液均用1/2 Hoagland营养液配制[16]。盐浓度每天递增50 mmol·L-1，以避免盐的冲击效应，直至达到预定浓度，而后每天以预定盐浓度的处理液浇灌一次，处理液的浇灌量为基质持水量的2倍，以保证之前积余的盐能够被全部冲出，从而维持各处理盐浓度的恒定。于处理30 d后幼苗七叶期测定各项相关指标。

1.3 相关指标的记录与测定

1.3.1种子萌发指标测定 每天观察种子的萌发情况，并记录发芽数(以胚轴长到约种子本身长度为发芽标准)。发芽率(GR)=∑Gt/T×100%(T为供试种子数)；发芽势(GP)=(n4/N)×100%(n4为种子发芽第4天的正常发芽粒数，N为供试种子数)；发芽指数(GI) =∑(Gt/Tt)(Gt为t天内的发芽数，Tt为对应Gt的发芽天数)；活力指数(VI)=GI×S(S为第7天每株平均鲜重)。相对盐害率=(对照发芽率-盐处理发芽率)/对照发芽率×100%[17]。待种子发芽至第7天时，从每个重复随机抽取10株菘蓝幼苗，分别测定其下胚轴长、胚根长、生长量，并称定每10株幼苗的全株鲜重。用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量[18]。

1.3.2幼苗相关指标测定 幼苗处理30 d后，各处理随机选取10株菘蓝幼苗分别测定其叶片和根的鲜重，而后置于烘箱中于105 ℃的杀青15 min，于60 ℃下烘干至恒重后称量叶片和根的干重。采用氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium,NBT)法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性[19]，采用愈创木酚法测定过氧化物酶(peroxidase, POD)的活性，试验重复3次[19]。采用磺基水杨酸法测定菘蓝叶片中的脯氨酸(proline)含量[20]。

采用模糊数学隶属函数法对5个产地菘蓝进行耐盐性综合评价, 利用公式：X(μ)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)，计算各测定指标的耐盐性隶属函数值，式中X为某一耐盐性指标的测定值，Xmax和Xmin分别为该指标的测定最大值及最小值，与菘蓝耐盐性呈负相关的指标用X(μ)=1-[(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)]计算。先求出不同盐浓度下各指标的隶属值，并将各隶属值累加求平均值。最后将计算所得各指标的隶属值再相加求平均值即得不同产地菘蓝的耐盐性指数[21]。

1.4 数据分析

用SPSS 19.0及Excel 2010进行数据的处理与分析，处理间差异性比较采用LSD法。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对不同产地菘蓝种子萌发率的影响

盐胁迫下，各产地的菘蓝种子萌发率均受到不同程度的抑制(图1)。HB、SB的菘蓝种子在50 mmol·L-1NaCl处理下的发芽率与对照(CK)无显著差异(P>0.05)；150 mmol·L-1NaCl处理下，HB发芽率与CK相比显著降低(P<0.05)，但仍然达到79.50%，维持在较高水平上，而SB发芽率急剧下降，比CK降低了39.00%，说明HB的菘蓝种子耐盐性较强，SB对高浓度盐耐受性较差。LT、AH、NB的菘蓝种子在CK的发芽率分别为57.50%、64.50%、59.00%，在100 mmol·L-1NaCl处理分别降低至38.00%、42.50%、29.00%，而在150 mmol·L-1NaCl处理下发芽率分别低至14.00%、30.00%、6.50%，说明LT、AH、NB的菘蓝种子自身活力较低，萌发过程受盐胁迫抑制明显，耐盐性较差。

2.2 盐胁迫对不同产地菘蓝种子发芽势、发芽指数及活力指数的影响

由表1可以看出，随盐浓度升高，不同产地间菘蓝的发芽势总体上均呈逐渐降低的趋势，且不同产地间菘蓝的发芽势存在差异。HB菘蓝各盐处理间的发芽势无显著差异(P>0.05)，150 mmol·L-1NaCl处理时发芽势仍达到77.00%，与CK相比下降了21.03%；NB产地在50 mmol·L-1NaCl处理时发芽势无显著变化(P>0.05)，而在150 mmol·L-1NaCl处理时下降了70.75%。AH、LT菘蓝的发芽势在50 mmol·L-1NaCl时显著降低，高浓度的盐胁迫对其种子萌发的抑制作用明显。盐胁迫条件下，菘蓝种子发芽指数及活力指数的变化规律与发芽率基本一致，其中HB、SB菘蓝种子各处理组的发芽指数及活力指数均高于其他产地，其耐盐性相对较强。随着盐浓度的增加，菘蓝种子的发芽指数和活力指数均逐渐降低，说明此时种子活力也逐渐降低，盐胁迫对种子萌发的抑制作用加强。100 mmol·L-1NaCl处理下各产地的菘蓝种子发芽指数与CK差异性均达到显著水平(P<0.05)，说明100 mmol·L-1NaCl对菘蓝种子而言已经为较高的耐受盐度。

图1 盐胁迫对不同产地菘蓝种子萌发率的影响Fig.1 Effect of salt stress on seed germination of I. indigotica from different areas HB：河北保定Baoding, Hebei；SB：山东滨州Binzhou, Shandong；NB：内蒙古包头Baotou, Inner Mongolia；LT：辽宁铁岭Tieling, Liaoning；AH：安徽亳州Bozhou, Anhui. 下同 The same below.

2.3 盐胁迫对5个产地菘蓝幼苗鲜重、下胚轴及胚根长度的影响

在150 mmol·L-1NaCl处理下，各产地菘蓝幼苗均出现了严重萎蔫甚至死亡、腐烂现象，故在幼苗生长指标的测定中除去该处理。随着盐浓度的升高，HB和SB菘蓝的幼苗鲜重、下胚轴及胚根长度呈先上升后下降的趋势(图2)。50 mmol·L-1NaCl下，HB幼苗鲜重、下胚轴及胚根长度与CK相比分别增加了27.06%、15.74%和4.34%，SB幼苗鲜重与下胚轴长度分别比CK分别增加了19.05%和9.97%，胚根长度与CK间无显著差异(P>0.05)。100 mmol·L-1NaCl下，HB和SB的幼苗鲜重、下胚轴及胚根长度较CK均显著降低(P<0.05)。其余3个产地(NB、LT、AH)菘蓝的幼苗鲜重、下胚轴及胚根长度则随着盐浓度的升高逐渐降低，各盐浓度处理间的差异显著(P<0.05)。说明，低浓度盐胁迫(50 mmol·L-1NaCl)促进了HB和SB菘蓝胚根的伸长及幼苗的生长，100 mmol·L-1NaCl明显抑制菘蓝幼苗的生长，更高浓度的盐胁迫则会造成幼苗的萎蔫甚至死亡。HB和SB菘蓝幼苗具有一定耐盐性，而其余3个产地菘蓝幼苗的耐盐性较差。

2.4 盐胁迫对5个产地菘蓝幼苗丙二醛含量的影响

盐胁迫下，植物膜质过氧化作用的加剧使得体内丙二醛积累。盐胁迫下，菘蓝幼苗的MDA含量随盐浓度的升高而增加(图3)。50 mmol·L-1NaCl下，HB、SB、NB菘蓝幼苗的MDA含量与对照间无显著差异(P>0.05)，在100 mmol·L-1NaCl处理下，HB、SB、NB、LT、AH 5个产地的幼苗MDA含量显著增加，分别为CK的1.51、1.87、2.16、2.70、1.98倍，说明100 mmol·L-1NaCl浓度处理对菘蓝幼苗明显构成了伤害，且这种伤害在LT菘蓝中最显著，而HB菘蓝幼苗对NaCl相对不敏感，造成的伤害较小，体现出较高的耐盐性。

表1 盐胁迫对不同产地菘蓝种子萌发的影响Table 1 Effects of salt stress on seed germination of I. indigotica from different areas (n=4)

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note：Different small letters in the same column show significant difference at 0.05 level. The same below.

图2 盐胁迫对5个产地菘蓝幼苗鲜重(A)、下胚轴(B)及胚根长度(C)的影响Fig.2 Effect of salt stress on the fresh weight (A), hypocotyl (B) and radicle length (C) of I. indigotica seedlings from five areas 不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。Different small letters show significant difference at 0.05 level. The same below.

2.5 盐胁迫对菘蓝幼苗生长的影响

图3 盐胁迫对5个产地菘蓝幼苗丙二醛含量的影响Fig.3 Effects of salt stress on MDA content of I. indigotica seedling from five areas

从表2可知，5个产地菘蓝幼苗叶片及根的鲜重和干重随着盐胁迫浓度的升高，总体上均呈下降的趋势。150 mmol·L-1NaCl胁迫后，5个产地菘蓝幼苗叶片及根的鲜重及干重均降至最低值，其中LT及AH的下降幅度显著高于其他3个产地。与各自对照相比，LT菘蓝幼苗叶片的鲜重、干重在150 mmol·L-1NaCl胁迫后分别下降了34.68%和38.10%，根的鲜重及干重分别下降了52.87%和46.15%；AH菘蓝叶片的鲜重和干重分别下降了48.62%和45.24%，根的鲜重及干重分别下降了58.16%和56.25%。说明盐胁迫对LT及AH菘蓝幼苗的生长抑制作用大于其他产地。

表 2 盐胁迫对菘蓝叶片和根鲜重及干重的影响Table 2 Effects of salt stress on fresh and dry weights of leaf blade and root of I. indigotica seedlings

2.6 盐胁迫对菘蓝幼苗保护酶活性的影响

盐胁迫下，5个产地菘蓝幼苗SOD与POD活性均随盐浓度的升高呈先上升后下降趋势(图 4)。其中，不同盐浓度下，HB、 SB和NB菘蓝幼苗的SOD活性无显著变化(P>0.05)。 LT和AH菘蓝幼苗的SOD活性均在100 mmol·L-1NaCl胁迫下达到最大值，分别为各自对照的1.19和2.61倍。当盐胁迫浓度升至150 mmol·L-1NaCl，LT和AH的SOD活性均开始下降。除AH外，其余产地菘蓝幼苗的POD活性均在100 mmol·L-1NaCl处理时达到最大值。

图4 盐胁迫对菘蓝保护酶活性的影响Fig.4 Effects of salt stress on protective enzyme activities of I. indigotica seedlings

图 5 盐胁迫对菘蓝脯氨酸含量的影响Fig.5 Effects of salt stress on proline content of I. indigotica seedlings

2.7 盐胁迫对幼苗脯氨酸含量的影响

随着盐胁迫程度的逐渐增加，5个产地菘蓝体内脯氨酸的含量均呈先升高后下降趋势，并均在100 mmol·L-1NaCl处理时达到最大值(图 5)。NB、LT和AH菘蓝幼苗的脯氨酸含量在100 mmol·L-1NaCl胁迫分别为各自对照的1.77、2.03和1.65倍。

表3 5个产地菘蓝种子及幼苗耐盐能力评价Table 3 Comprehensive appraisal of salt resistance of I. indigotica seed and seedling from five areas

2.8 5个产地菘蓝种子萌发期的耐盐性评价

通过隶属函数法，综合发芽势、发芽指数、活力指数、相对盐害率、苗鲜重、下胚轴长、胚根长度、MDA含量、单株苗鲜重、单株苗干重、SOD活性、POD活性和脯氨酸含量13个指标对5个不同产地菘蓝种子萌发期的耐盐性进行评价(表 3)。5个材料种子萌发期的耐盐顺序由强到弱依次为：HB>SB>LT>NB>AH。HB的菘蓝种子显示出较强的耐盐能力，明显优于其他产地的菘蓝种子，这与上述的分析结果一致。

3 讨论

在对菘蓝种子耐盐性的研究中发现，随着盐浓度的不断增加，不同产地菘蓝的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均逐渐降低，相对盐害率逐渐升高，低浓度盐胁迫对菘蓝种子发芽的影响较小，高浓度表现出强烈的抑制效应，这与孟红梅等[22]的研究一致。同一盐浓度对不同产地菘蓝种子萌发的抑制程度不同，说明不同产地菘蓝种子耐盐能力具有差异，这可能与不同产地菘蓝居群自身的遗传差异性有关。本研究中，SB、HB产地菘蓝的发芽率、发芽势均显著高于其他产地的菘蓝种子，表现出了较强的耐盐性。不同产地菘蓝在100 mmol·L-1NaCl浓度处理时，发芽率、发芽势、活力指数均显著降低，150 mmol·L-1NaCl下则大量萎蔫腐烂，甚至死亡，这表明，对菘蓝而言,100 mmol·L-1NaCl为菘蓝种子的极限耐受盐浓度，该盐胁迫浓度下种子吸水困难，胚乳难以动用所储藏物质，呼吸作用受阻，从而种子整体的活力受到明显限制，发芽的能力显著降低，甚至不能正常萌发[23]。

植物在遭遇盐胁迫时生长受到抑制，叶面积减小，同时减缓了茎的伸长生长[24]。随着盐胁迫程度的增加，5个产地菘蓝幼苗的下胚轴长、胚根长及鲜重均呈整体下降趋势，而在150 mmol·L-1NaCl处理时由于盐浓度过高导致菘蓝幼苗出现严重失水萎蔫甚至死亡、腐烂的现象。研究发现10～20 mmol·L-1NaCl处理能促进菘蓝幼苗生长，40～100 mmol·L-1NaCl处理时幼苗生长显著受抑制[25]。对种子耐盐性的研究结果表明，HB、SB产地菘蓝幼苗在低盐浓度(50 mmol·L-1NaCl)处理时下胚轴长和鲜重比对照组有所增加，说明低浓度的盐胁迫促进了这2个产地菘蓝幼苗生长发育，而其余3个不同产地菘蓝幼苗的下胚轴长、胚根长及鲜重则随盐胁迫浓度的增加呈逐渐降低趋势。

高盐胁迫会导致植物体内的保护酶系统急剧下降，活性氧大量积累，致使细胞的膜质过氧化作用加剧，丙二醛大量积累[26]。作为膜脂过氧化作用的产物，丙二醛(MDA)含量在一定程度上可以反映植物受伤害的程度。本研究结果表明：菘蓝幼苗体内MDA含量随盐胁迫浓度的升高而增加。在高盐浓度(100 mmol·L-1NaCl)处理时，5个产地菘蓝幼苗体内MDA含量显著上升，与对照间差异达到极显著水平(P<0.01)。表明高盐浓度的胁迫已经超出了菘蓝幼苗自身的调节能力，导致膜的损伤加重，丙二醛含量大量积累。不同产地菘蓝在抵御盐害时具有差异，盐胁迫下HB的菘蓝体内丙二醛(MDA)积累较少，受盐胁迫伤害程度较小；而NB、LT、AH菘蓝幼苗对盐的耐受能力较差，在100 mmol·L-1NaCl胁迫下菘蓝体内的膜质过氧化程度急剧增加，MDA含量显著上升。

在对菘蓝幼苗耐盐性研究中发现，5个产地菘蓝叶鲜重及干重，根鲜重及干重总体上均呈明显下降趋势，且生物量均在150 mmol·L-1NaCl胁迫时降至最低，这说明高浓度的盐胁迫会显著抑制菘蓝幼苗的生长。

50 mmol·L-1NaCl轻度盐胁迫能够促进菘蓝幼苗SOD和POD活性的增加，这说明轻度的盐胁迫能够诱导菘蓝体内保护酶活性的增强，从而提高盐渍环境下菘蓝幼苗的适应能力。而过高浓度的盐胁迫(150 mmol·L-1NaCl)，超出了菘蓝幼苗自我调节能力极限，导致体内活性氧的大量积累与保护酶结构的损坏，致使清除活性氧的能力下降，保护酶活性显著降低[27]。

盐胁迫下，脯氨酸作为植物体内重要的渗透调节物质，能够维持膜结构稳定，清除植物体内的活性氧，其含量与植物的抗逆能力紧密相关[28]。5个产地菘蓝幼苗的脯氨酸含量均随着盐浓度的升高呈先升高后降低的趋势，并在100 mmol·L-1NaCl胁迫时达到峰值。这说明，盐胁迫下菘蓝通过体内大量积累脯氨酸来抵抗盐渍环境，从而维持其生长及生理代谢过程的正常进行。高于100 mmol·L-1NaCl的胁迫则超出了菘蓝幼苗的渗透调节能力，导致体内脯氨酸合成受阻，含量显著降低。

综合5个不同产地菘蓝幼苗发芽势、发芽指数、活力指数、相对盐害率、苗鲜重、下胚轴长、胚根长、MDA含量、单株苗鲜重、单株苗干重、SOD活性、POD活性和脯氨酸含量13个指标的耐盐性分析结果，各产地菘蓝种子萌发期的耐盐性强弱依次为：HB>SB>LT>NB>AH，HB产地菘蓝种子较其他产地显示出更强的耐盐性。