东达山高寒草甸8种植物气孔特征沿土壤水分梯度的变化

张大才，朱玉怀，李双智

(西南林业大学林学院，云南 昆明 650224)

植物气孔特征对外界环境因子变化的可塑性强，随环境因子的变化而变化，以适应环境[1-3]，甚至同一植株不同冠层间叶片气孔密度都存在显著差异[4]，气孔特征与叶片功能性状之间也存在一定的联系[5]。但是，不同气孔特征(如气孔密度、长度与宽度)对外界因子变化的响应不同，如气孔密度与大小在外界胁迫下呈相反的变化趋势[6-7]。同时，不同环境因子对气孔特征的影响也不同，如高光处理下气孔密度和大小增大[8-9]，干旱胁迫下植物叶片气孔密度增大[10-11]，或者减小[12-13]。干旱是自然界中植物受到的最常见的外界胁迫因子，在干旱胁迫下植物气孔特征呈多种变化格局，其机制还需进一步研究。目前，更多的研究集中于在实验条件下干旱胁迫植物，分析其气孔特征的变化，而很少在自然状态下，沿生境干旱化梯度取样，分析气孔特征沿土壤水分梯度的变化。

根据植物对水分的依赖程度可分为沼生、湿生、旱生等类型，每种类型的植物都要求有一个相对适宜的土壤水分范围。相同土壤水分条件下，不同类型植物受到的影响或胁迫可能不同，如湿润生境中，对湿生植物而言为适宜的土壤含水率，而对旱生植物而言就存在水分胁迫。因此，按植物对水分的依赖类型分别分析气孔特征与土壤含水率之间的关系，才能更客观反映植物叶片气孔特征随土壤水分梯度的变化规律。

高寒草甸是青藏高原分布面积最大的植被类型之一，受全球变化和放牧干扰的双重影响，高寒草甸分布面积正在快速减小[14]。而且，青藏高原冬季温度升高，积雪量下降，生境干旱化现象严重[15]。在生境干旱化过程中，高寒草甸退化演替，嵩草属(Kobresia)植物在群落中的重要值逐步下降，而“杂草”类植物的重要值增加[16]。这表明不同植物对土壤水分的依赖程度不同，生态适应机制不同，叶表皮气孔特征与土壤含水率之间的关系不同。本研究选择藏东南高寒草甸的8种优势或常见植物，沿生境干旱化梯度采样，分析气孔特征沿土壤水分梯度的变化规律。因此，本研究目的有：1)分析植物叶片气孔密度沿土壤水分梯度的变化规律。2)气孔大小与土壤含水率之间的关系。3)根据植物气孔特征与土壤水分梯度之间的关系划分植物对水分的依赖类型。

1 材料与方法

1.1 研究地概况与植物叶片的采集

研究地点位于藏东南左贡县东达山，该山山体高大，垭口海拔5008 m，地理位置、地形地貌等信息在已发表文献中均有详细介绍[17-18]。研究地点地形呈凹形，沟谷地形平坦，溪流纵贯其间，生境湿润；两侧斜升，生境干旱。采用典型取样方法，从分布于沟谷溪边的高寒草甸开始设置样方，然后沿坡面每间隔一定的距离设置样方，直至高寒草甸边缘，共设置10个样方(表1)。选择植物群落内优势度高、分布范围广的物种作为研究对象，包括4种嵩草属植物，即矮生嵩草(Kobresiahumilis)、线叶嵩草(K.capillifolia)、大花嵩草(K.macrantha)、高山嵩草(K.pygmaea)，以及4种双子叶植物，即小大黄(Rheumpumilum)、圆穗蓼(Polygonummacrophyllum)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)和鸭跖草(Commelinacommunis)，采集健康植株叶片，置于FAA固定液(50%酒精∶乙酸∶福尔马林溶液=90∶5∶5)中保存[19]，并采集凭证标本。所有实验材料采集于2016年8月。

1.2 土壤含水率的测度

在样方内选取3个点取土样，土钻内径为2.5 cm。取出土样后去除石砾、根与茎，然后装入铝盒，用精度为0.01 g电子秤称重。在实验室内将装土样的铝盒放入烘箱在(105±2) ℃条件下烘烤12 h。烘烤结束后取出铝盒，冷却至室温后(约需30 min)立即称重。以质量含水量测定土壤含水率，即土壤中水分的质量与干土质量的百分比，又称为重量含水量。

表1 样地信息Table 1 Information of sample plots

1.3 叶表皮的制片

叶表皮临时制片过程为：1)软化：植物叶片在FAA固定液中容易变脆、变硬而直接影响叶表皮的获取，在实验开始前把植物叶片置于软化剂(50%酒精∶甘油=1∶1)中软化2～3 d。2)离析：将软化后的植物叶片用蒸馏水冲洗干净后放于10%的次氯酸钠(NaClO)溶液中进行离析，离析时间大约为30～40 min。3)取样和剥离：植物叶片气孔密度、大小受叶片的着生部位[20-21]、发育程度[22-24]，以及同一叶片的不同部位的影响[25]。本研究叶表皮材料从叶片长度2/3处(从叶基至叶尖方向)获取，截取小段叶片进行离析，待叶片颜色变白时取出，经蒸馏水冲洗后剥离表皮。4)染色：采用滴染法，用番红-固绿进行染色，染色时间为1 min。5)制片：染色后样品用蒸馏水反复冲洗干净后盖上盖玻片，制成临时装片。

1.4 显微观察与测量

将制成的临时装片在显微镜下进行镜检，使用显微图像分析系统(ZEISS Axiovert 200M)计数气孔数，测量气孔长度与保卫细胞宽度，并拍照。1)气孔密度的计算：每个样方中，每个物种选取50张临时制片，计数视野中气孔的数量，每张计数10个视野的气孔数量，并求算平均值(N)。用镜台测微尺测得显微镜视野的直径，计算半径r(mm)、视野面积S=πr2(mm2)，气孔密度D=N/S(个·mm-2)。2)气孔长度与保卫细胞宽度测量：每个样方中，每个物种选取10张临时制片，每张制片随机选取1个视野，每个视野随机选取5个气孔，测量气孔长度(μm)和保卫细胞宽度(μm)，并以此衡量气孔大小，其值越大表明气孔越大。

1.5 数据分析

使用SPSS 17.0统计分析软件分析气孔密度、长度和保卫细胞宽度与土壤含水率之间的回归关系，遵循阶数越低越好的原则。使用Canoco 4.5软件分析气孔特征沿水分梯度的变化，由于4种双子叶植物和4种嵩草属植物最长梯度值分别为0.133和0.231，因此选择RDA排序分析气孔特征与土壤水分梯度之间的关系。4种双子叶植物叶片上、下表皮均有气孔分布，以上、下表皮气孔密度之和分析气孔密度，但分别分析上、下表皮气孔长度和保卫细胞宽度与土壤含水率之间的关系。

2 结果与分析

同种植物气孔形状特征在不同水分梯度之间的变化较小，但密度与大小差异较大(图1)。矮生嵩草气孔的平均密度最大，其次为圆穗蓼与大花嵩草，而珠芽蓼上表皮气孔的平均密度最小；高山嵩草气孔长度最大，其次为线叶嵩草和鸭跖草下表皮，圆穗蓼下表皮的气孔长度最小；高山嵩草保卫细胞宽度最大，其次是大花嵩草和线叶嵩草，而圆穗蓼下表皮保卫细胞宽度最小；相对于4种双子叶植物，4种嵩草属植物气孔长度与保卫细胞宽度较大(表2)。

表2 气孔密度、长度和保卫细胞宽度平均值及与土壤含水率之间的复相关关系Table 2 The mean values of stomatal density and length, and guard cell width for 8 species, and the multi-correlation between stomatal characteristics and soil moisture

*P<0.05, **P<0.01.分别指：1)方差分析表明4种双子叶植物气孔特征在上、下表皮间差异显著；2)复相关关系中，气孔特征与土壤含水率之间的相关性显著。Indicating seperately: 1) ANOVA showing the difference of stomatal features between adaxial and abxial epidermises is significant for 4 species of dicotyledon, and 2) the relationship between stomatal features and soil moisture is significant in the complex correlation.

2.1 气孔密度沿土壤水分梯度的变化

气孔密度与土壤含水率之间的关系呈现出4种不同的变化趋势(图2)。线叶嵩草、圆穗蓼气孔密度与土壤含水率显著线性正相关(P<0.01；图2a, b)；珠芽蓼、矮生嵩草气孔密度与土壤含水率显著线性负相关(P<0.01；图2c, d)；大花嵩草、高山嵩草气孔密度与土壤含水率之间的相关性不显著(P>0.05；图2e, f)；小大黄、鸭跖草气孔密度随土壤含水率的变化呈现单峰曲线分布格局(P<0.01；图2g, h)。

图1 植物叶片气孔分布特征Fig.1 The stomatal distribution of leaf for four plants of genus Kobresia and abaxial epidermis of dicotyledon 最湿润与最干旱生境分别指该物种分布的土壤水分梯度范围内土壤含水率最高和最低的生境。The wettest and driest habitat of one species is respectively the one with the highest and lowest soil moisture within its gradients of soil moisture.

2.2 气孔长度沿土壤水分梯度的变化

线叶嵩草、大花嵩草气孔长度与土壤含水率显著线性正相关(P<0.01；图3a, b)；圆穗蓼气孔长度与土壤含水率显著线性负相关(P<0.01；图3c, d)；高山嵩草、珠芽蓼上表皮气孔长度与土壤含水率之间的相关性不显著(P>0.05；图3e, f)；珠芽蓼下表皮气孔长度与土壤含水率相关性低(图3g)；矮生嵩草、小大黄、鸭跖草气孔长度随土壤含水率的增加而呈现单峰曲线格局(P<0.01；图3h～l)。4种双子叶植物中，上、下表皮气孔长度沿土壤水分梯度的变化格局一致(图3c～d, f～g, i～l)。鸭跖草叶片下表皮气孔长度显著大于上表皮(P<0.01)，而珠芽蓼和圆穗蓼叶片下表皮气孔长度显著小于上表皮(P<0.01)，小大黄叶片上、下表皮气孔长度的差异不显著(P>0.05；表2)。

2.3 保卫细胞宽度沿土壤水分梯度的变化

保卫细胞宽度沿土壤水分梯度的变化呈现出4种分布格局(图4)。线叶嵩草保卫细胞宽度与土壤含水率显著线性正相关，但相关性较低(P<0.01；图4a)；圆穗蓼保卫细胞宽度与土壤含水率显著线性负相关(P<0.01；图4b, c)；大花嵩草、高山嵩草、珠芽蓼保卫细胞宽度与土壤含水率之间的相关性不显著(P>0.05；图4d～g)；矮生嵩草、小大黄、鸭跖草保卫细胞宽度随土壤含水率的增加而呈现单峰曲线分布格局(P<0.01；图4h～l)。4种双子叶植物中，上、下表皮保卫细胞宽度沿土壤水分梯度的变化一致(图4b～c, f～g, i～l)，除鸭跖草下表皮保卫细胞宽度显著大于上表皮外，其余3种均为下表皮保卫细胞宽度显著小于上表皮(P<0.01；表2)。

2.4 气孔特征与土壤含水率之间的复相关关系和RDA排序

除高山嵩草外，其余7种植物叶片气孔特征与土壤含水率之间的复相关系数高，双子叶植物下表皮气孔特征与土壤含水率之间的相关性高于上表皮(表2)。在气孔特征与土壤含水率之间的复相关关系中，气孔密度对线叶嵩草、圆穗蓼、珠芽蓼、小大黄、鸭跖草5种植物的影响最大，气孔长度对大花嵩草和矮生嵩草2种植物的影响最大，而保卫细胞宽度和高山嵩草气孔特征与土壤含水率之间的相关性较低(表2)。

根据气孔特征沿土壤水分梯度的RDA排序结果，大花嵩草、鸭跖草、小大黄、线叶嵩草和矮生嵩草气孔特征与土壤含水率之间的关系紧密；高山嵩草、珠芽蓼、圆穗蓼的气孔密度、长度和保卫细胞宽度和土壤含水率之间的关系不同，且不紧密(图5)。根据物种气孔特征与土壤含水率之间关系，4种嵩草属植物对土壤水分依赖程度由高到低的顺序为：大花嵩草>矮生嵩草>线叶嵩草>高山嵩草；4种双子叶植物的顺序为：鸭跖草>小大黄>珠芽蓼>圆穗蓼。

图2 气孔密度沿土壤水分梯度的变化Fig.2 Variation of stomatal density along the gradient of soil moisture

a：线叶嵩草K.capillifolia；b：圆穗蓼P.macrophyllum；c：珠芽蓼P.viviparum；d：矮生嵩草K.humilis；e：大花嵩草K.macrantha；f：高山嵩草K.pygmaea；g：小大黄R.pumilum；h：鸭跖草C.communis.

a:线叶嵩草K.capillifolia；b:大花嵩草K.macrantha；c～d:圆穗蓼上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofP.macrophyllum；e:高山嵩草K.pygmaea；f～g:珠芽蓼上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofP.viviparum；h:矮生嵩草K.humilis；i～j:小大黄上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofR.pumilum；k～l:鸭跖草上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofC.communis.

a:线叶嵩草K.capillifolia；b～c:圆穗蓼上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofP.macrophyllum；d:大花嵩草K.macrantha；e:高山嵩草K.pygmaea；f～g:珠芽蓼上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofP.viviparum；h:矮生嵩草K.humilis；i～j:小大黄上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofR.pumilum；k～l:鸭跖草上、下表皮The adaxial and abaxial epidermis ofC.communis.

图5 气孔特征的RDA排序Fig. 5 The RDA ordination of stomatal characteristics

D：气孔密度Stomatal density；L：气孔长度Stomatal length；W：保卫细胞宽度Guard cell width。a： 4种嵩草属植物4 species ofKobresiagenus，1：大花嵩草K.macrantha；2：线叶嵩草K.capillifolia；3：矮生嵩草K.humilis；4：高山嵩草K.pygmaea；b： 4种双子叶植物4 species of dicotyledon，1：鸭跖草C.communis；2：小大黄R.pumilum；3：珠芽蓼P.viviparum；4：圆穗蓼P.macrophyllum；ad: 上表皮Adaxial epidermis；ab: 下表皮Abaxial epidermis.

3 讨论

3.1 气孔密度沿土壤水分梯度的变化

8种植物气孔密度与土壤含水率之间呈现为4种关系(图2)，充分表明不同植物叶片气孔密度对土壤水分条件变化的适应性不同，气孔密度对土壤水分条件的响应复杂。随着生境干旱程度的增加，植物叶片气孔密度降低，以降低蒸腾，是植物适应干旱生境的特征[13,26]，本研究中线叶嵩草、圆穗蓼气孔密度与土壤含水率之间的关系符合这一规律(图2a, b)。但是，更多研究结果都表明在干旱胁迫下植物叶片的气孔密度增加，如本研究中珠芽蓼、矮生嵩草气孔密度与土壤含水率之间的关系(图2c, d)，认为耐旱性强的植物气孔密度大[27-30]，气孔密度的增加有利于提高水分利用效率[7,31]。小大黄和鸭跖草气孔密度与土壤含水率之间呈现非线性关系(图2g, h)，与胡杨(Populuseuphratic)[32-33]、枣树(Ziziphusjujuba)[34]叶片气孔密度随土壤含水率的变化一致，是干旱胁迫下气孔密度最常见的变化趋势[35]。说明同种植物气孔密度对水分胁迫不同强度的响应不同，轻度、中度干旱胁迫抑制叶片表皮细胞伸长，叶片面积减小而导致气孔密度升高[36]；而重度干旱胁迫抑制了气孔的发生，使气孔密度降低[37]。

本研究中8种植物气孔密度与土壤含水率之间的关系，还可以说明：1)同属植物之间气孔密度存在差异，其耐旱性也不同。本研究中嵩草属的4种植物，以及蓼属的2种植物气孔密度均存在差异。很多研究成果都推荐将植物气孔密度作为评价植物抗旱性的重要指标[38-40]，因此研究结果可为高寒草甸恢复草种选择提供依据。2)除气孔密度外，气孔分布也影响植物的耐旱性。一般认为双子叶植物中气孔主要分布于下表皮而上表皮气孔分布少或没有分布的特征是耐旱的解剖构造[41-42]。本研究涉及的4种双子叶植物中，鸭跖草在水分梯度上的分布范围窄，而耐旱性最差，除气孔密度低的原因外，气孔分布特征对其耐旱性差也有较大的影响，气孔在上、下表皮均有分布，且上表皮平均密度高于下表皮(表2)。

3.2 气孔大小与土壤水分之间的关系

大花嵩草和线叶嵩草叶片气孔大小随土壤干旱程度的增加而减小(图3a, b和图4a)，与玉米(Zeamays)[6]、水稻[43]、矮嵩草、高山唐松草(Thalictrumaplinum)、垂穗披碱草(Elymusnutans)、麻花艽(Gentianastraminea)[11]、刺槐(Robiniapseudoacacia)[44]、大豆(Glycinemax)[36]等植物叶片在干旱胁迫下气孔大小的变化一致。一般认为植物气孔大小与其运动敏捷性相关，气孔越小运动越敏捷，对外界水分变化反应越及时，水分胁迫条件下植物叶片气孔变小更有利于调节气孔的关闭与开张[45]。

但是，圆穗蓼上、下表皮气孔大小随土壤干旱程度的增加而增加(图3c～d和图4b～c)。圆穗蓼的耐旱性最强(表2)，是典型的旱生型植物，土壤含水率越高对其胁迫越大，因此其气孔特征的变化与所受外界胁迫一致。小大黄、鸭跖草、矮生嵩草、珠芽蓼气孔长度与保卫细胞宽度随土壤含水率的增加基本呈现先增加后减小的单峰曲线格局(图3f～l和图4h～l)，与紫花苜蓿(Medicagosativa)在干热胁迫下气孔大小的变化一致[46]。这些物种分布的生境湿润，土壤含水率过高或过低对其生长都将造成胁迫，因此其气孔大小与土壤含水率之间的关系呈现单峰曲线格局。植物叶片气孔大小沿土壤水分梯度的变化格局应该从植物受土壤水分胁迫的角度去理解，当植物受到土壤水分胁迫时气孔都变小，运动更敏捷，对环境变化响应更及时。

3.3 不同生境类型植物的划分

根据气孔密度、保卫细胞长度和宽度与土壤含水率之间的关系，随着土壤干旱化程度的增加，不同植物气孔特征的变化不同，根据植物对土壤水分的依赖程度，可以划分为4种类型。1)沼生型，仅大花嵩草一种，随土壤干旱程度的增加气孔密度呈增加趋势、气孔大小显著减小。该类植物对土壤水分依赖程度高，在水分梯度上的分布范围窄，干旱是其生长的胁迫因素，以增加气孔密度和减小气孔大小适应干旱胁迫。2)湿生型，包括鸭跖草、小大黄、珠芽蓼和矮生嵩草，气孔特征与土壤含水率之间的关系多呈现为单峰曲线格局，湿润土壤是最适宜的分布生境，土壤含水率过高或过低都是其生长的胁迫因子。鸭跖草和小大黄是典型的湿生型植物，气孔特征与沿土壤水分梯度的变化均呈现为单峰曲线格局；矮生嵩草气孔特征与土壤含水率的复相关关系中，气孔大小和保卫细胞宽度的复相关系数高，对土壤水分条件变化响应明显；珠芽蓼是非典型的湿生型植物，气孔密度与土壤含水率之间的关系表现为沼生型植物的特征，而气孔大小表现出湿生型植物的特征，是沼生型向湿生型的过渡类型。3)旱生型，包括圆穗蓼和线叶嵩草，它们的适宜生境偏干旱，土壤含水率过高是其生长的胁迫因子，气孔特征随土壤干旱程度增加的变化趋势与沼生型植物相反，随土壤干旱程度的增加气孔密度减小，气孔大小增大(其中线叶嵩草气孔大小减小，但气孔密度起主要作用，所以归为该类)。4)广布型，仅高山嵩草一种，气孔特征与土壤含水率之间的相关性不显著，气孔特征对土壤含水率的变化不敏感。

4 结论

在植物气孔特征对土壤含水率变化的响应中，多数情况下气孔密度起主要作用，其数量和在上、下表皮的分布都影响植物对水分的依赖程度，其次是气孔大小，影响植物气孔开张与关闭的灵敏度。沼生、湿生和旱生型植物在相同的土壤水分梯度上受到的水分胁迫程度不同，气孔特征与土壤水分梯度之间呈现多种变化格局。因此，分析植物气孔特征沿土壤水分梯度的变化时应结合植物受水分胁迫的程度。在水分胁迫条件下植物叶片气孔密度增大，大小减小是其普遍变化规律，或起主要作用的气孔特征符合这一变化规律。