60Co-γ射线辐射对苜蓿幼苗生长和两种抗氧化酶活性的影响

李 红， 李 波， 杨 曌， 徐婉玉

(1.黑龙江省畜牧研究所，黑龙江 齐齐哈尔 161005； 2.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

诱变育种是人为地利用物理、化学因素诱发作物产生遗传性变异，依据育种目标，经过人工选择、鉴定、选育新品种，获得有价值新类型的一种育种方法，现已成为常规育种与现代技术有机结合的现代育种技术。在牧草育种上常用的电离辐射和非电离辐射，由于各种射线电离密度和生物效应不同，所引起的突变率有所差异，其中最常用的为γ射线和X射线[1]。60Co-γ射线辐照是最为有效的人工诱变育种方法之一，已经在农作物育种中得到广泛应用。在牧草方面，辐射诱变育种工作起步较晚，研究尚少。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培利用最广泛的优良豆科牧草, 具有营养价值高、适口性好等特点, 在世界各地的畜牧业中发挥着非常重要的作用。同时，紫花苜蓿对改善盐碱化土壤理化性质,恢复退化草地植被,牧草质量和产量的提高等,均有着重要作用[2]。但目前利用60Co-γ射线辐照人工诱变育种紫花苜蓿的研究相对较少。本研究探讨不同60Co-γ射线辐照剂量对紫花苜蓿种子的幼苗生长状况、叶片和根抗氧化酶活性代谢的影响，为紫花苜蓿的人工诱变育种提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及辐射处理

以黑龙江畜牧研究所提供龙牧806苜蓿干种子为材料。60Co-γ辐射源由中国农业科学研究院原子能利用研究所提供，辐射剂量依次为600 Gy，900 Gy，1 200 Gy，1 500 Gy，1 800 Gy六个剂量，剂量率15 Gy·min-1，每份处理50 g种子，以同一批次相同数量未经处理的种子作为对照(CK)。

1.2 方法

1.2.1幼苗的培养 取5种剂量的60Co-γ(600，900，1 200，1 500和1 800 Gy)射线辐射处理和未辐射的苜蓿种子，采用土培的方法将其种植在营养钵中(针叶土、营养土和珍珠岩按1∶2∶0.5比例进行混合)，定期浇水，待幼苗长至三叶一心期后，将苜蓿幼苗取出备用。

1.2.2形态指标测定 出苗率和成苗率：每个处理播种5个花盆，每盆播种15粒种子(辐射和未辐射种子)待15 d后统计每盆中种子的出苗数，待实生苗长出5～6 片真叶(约30 d左右)后，统计幼苗数，计算种子幼苗的成苗率。

出苗率=(出苗数/播种种子总数)×100%

成苗率=(成苗数/播种种子总数)×100%

幼苗鲜重、干重和含水量：对培养至45 d幼苗，小心取出幼苗，用水冲洗净根部的泥土，滤纸吸干其水分，每个辐射剂量和对照随机选取10株幼苗，用电子天平称取幼苗的鲜重即为幼苗的鲜重，自然风干后测定其干重即为幼苗的干重，并计算其含水量。

幼苗长度：随机选取培养45 d每个辐射剂量和对照10株具代表性的苜蓿幼苗，利用米尺分别测量地上茎长度、主根长度和幼苗总长度，计算其平均值。

1.2.3抗氧化酶活性测定 对不同60Co-γ射线辐射剂量苜蓿种子的幼苗叶片和根进行过氧化物酶(peroxidase，POD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)活性的测定，过氧化物酶活性采用愈创木酚比色法，过氧化氢酶活性采用紫外吸收法，重复三次。

1.3 数据分析

用Excel软件进行作图，用SPSS 17.0软件进行数据处理及相关分析。

2 结果与分析

2.1 不同剂量60Co-γ射线辐射对幼苗生长的影响

2.1.1种子出苗率和成苗率的影响60Co-γ辐射处理后苜蓿干种子的出苗率和成苗率的变化见图1，经过60Co-γ辐射处理后，苜蓿干种子的出苗率和成苗率呈现先上升后下降的变化趋势。辐射后种子的出苗率在低剂量(600 Gy)促进其出苗，出苗率最高为77.33%，比对照组增加6.42%，1 800 Gy高辐射剂量种子的出苗率最低，为48.67%。经过辐射后600 Gy辐射剂量以上种子的出苗率均小于对照组。辐射剂量为900、1 200、1 500和1 800 Gy种子的出苗率分别比对照组降低了15.60%、21.01%、28.44%和33.03%。低剂量600 Gy对成苗率影响不大，900 Gy以上辐射剂量对出苗率影响极大，与对照比较差异达到了极显著的水平(P<0.01)，而1 200～1 800 Gy辐射剂量间比较差异不显著。

辐射后种子的成苗率在低剂量(600 Gy)促进其成苗率最高为77.33%，比对照组增加了6.42%，1 800 Gy高辐射剂量种子的幼苗不能成苗。经过辐射后600 Gy辐射剂量以上种子的出苗率均小于对照组。辐射剂量在900、1 200、1 500和1 800 Gy种子的成苗率分别比对照组降低了12.13%、37.47%、51.89和100%，900 Gy辐射剂量以上与对照比较差异极显著(P<0.01)，说明600 Gy低剂量辐射对苜蓿干种子的成苗率的影响不大，而高剂量辐射对苜蓿干种子的成苗率的影响比较大，甚至导致种子出苗后死亡。

图1 60Co-γ辐射苜蓿种子的出苗率和成苗率的变化Fig.1 The changes of germination rate and survival rate of alfalfa seeds by 60Co-γ radiation.注：不同字母代表同一列不同剂量辐射间比较，小写字母代表0.05水平，大写字母代表0.01水平，下同Note: Different letters in the same column represent the comparison of different dose of radiation , lowercase letters indicate the difference at the level of 0.05, and capital letters indicate the difference at the level of 0.01. The same as below

2.1.2幼苗鲜重、干重和含水量的影响60Co-γ辐射处理后苜蓿种子的幼苗的鲜重、干重和含水量的影响见图2，随着辐射剂量的增加，各处理组的幼苗的鲜重、干重和含水量均呈现下降的变化趋势。

辐射剂量越高幼苗的鲜重、干重和含水量越低，在5组辐射处理组中，辐射剂量为600 Gy的幼苗的鲜重量、干重和含水量最大，分别为14.92 g，3.74 g和13.00 g，1500 Gy辐射剂量的幼苗的鲜重、干重和含水量最小，分别为6.64 g，1.16 g和5.49 g。在600、900、1200和1500 Gy辐射剂量下，幼苗的鲜重分别比对照降低10.87%、33.71%、53.60%和60.32%，干重分别比对照降低19.07%、34.14%、65.21%和69.07%，含水量分别比对照降低8.51%、33.59%、50.18%和57.80%。辐射处理后苜蓿种子的幼苗的鲜重、干重和含水量与对照比较差异极显著(P<0.01)，说明辐射处理对其幼苗的鲜重、干重和含水量影响极大(P<0.01)。

图2 60Co-γ射线辐射苜蓿种子的幼苗鲜重、干重和含水量的变化Fig.2 The change of fresh weight, dry weight and moisture content of seedling of alfalfa by 60Co-γ radiation

2.1.3幼苗长度的影响 苜蓿种子经60Co-γ辐射不同剂量处理后，其幼苗的总长度、地上茎长度和主根长度的影响见图3，随着辐射剂量的增加，各处理组的幼苗总长度、地上茎长度均呈现先增加后降低的变化趋势，主根长度出现降低的变化趋势。幼苗的生长对辐射反应比较敏感，主要通过幼苗的地上茎长度和地下主根长度指标的变化反应出来，经60Co-γ射线辐射处理后种子的生长幼苗，表现为低剂量辐射促进地上茎的生长，高辐射剂量抑制其地上茎和地下主根部分的生长，且随着诱变剂量的增高，地下主根逐渐变得短粗。

幼苗的地下主根长度表现为随着辐射剂量的增加抑制作用增加，1 500 Gy辐射剂量下主根长度仅为2.20 cm，在600、900、1 200和1 500 Gy辐射剂量下，幼苗的主根长度分别比对照降低21.93%、38.26%、60.19%和65.79%，1 200和1 500 Gy辐射剂量下对主根的长度抑制作用比较强，辐射与对照比较差异极显著(P<0.01)，低剂量与高剂量比较差异显著(P<0.05)。

幼苗的地上茎长度的影响表现为随着辐射剂量的增加抑制作用增加，600和900 Gy低剂量辐射促进苜蓿幼苗地上茎的生长，分别比对照增加25.13%和15.41%，1 200和1 500 Gy中度剂量辐射剂量抑制苜蓿幼苗地上茎的生长，分别比对照降低19.14%和29.84%，说明1 200 Gy辐射剂量以上抑制苜蓿幼苗的地上茎生长，与对照和低辐射剂量比较差异极显著(P<0.01)。

随着辐射剂量增加幼苗总长度降低，辐射剂量为600 Gy的幼苗总长度最高为33.21 cm，比对照增加了25.13%，1 500 Gy辐射剂量的幼苗总长度最低为16.31 cm。在600和900低剂量辐射下，幼苗的总长度分别比对照增加了25.13%和15.41%，1 200和1 500 Gy中度剂量辐射处理幼苗总长度与对照比较差异极显著(P<0.01)，低剂量辐射与高剂量之间对幼苗总长度产生极显著差异(P<0.01)。辐射对苜蓿幼苗主根的影响最大，进而影响苜蓿幼苗的总长度。

图3 60Co-γ射线辐射苜蓿种子的幼苗长度和主根长度的变化Fig.3 The changes of seedling length and root length of alfalfa seeds by 60Co-γ radiation

2.2 不同剂量60Co-γ射线辐射对苜蓿叶片两种酶活性的影响

2.2.1过氧化物酶活性的影响 不同剂量60Co-γ 射线辐射下的苜蓿种子，其幼苗叶片和根POD活性的变化见图4，苜蓿叶片和根的POD活性随着辐射剂量的增加呈现先上升后下降的变化趋势，辐射处理增加苜蓿叶片和根POD的积累，辐射剂量900 Gy时苜蓿叶片和根POD活性达到最大值，分别为3 343.75 U·g-1Fw·min-1和3 060.42 U·g-1Fw·min-1。在600、900、1 200和1 500 Gy60Co-γ辐照剂量的叶片POD活性分别比对照组增加39.00%、53.08%、40.44%和37.58%，根POD活性分别比对照组增加7.78%、58.81%、52.76%、27.85%。苜蓿幼苗叶片和根POD活性方差分析显示，除600 Gy外，其它辐射组与对照组比较差异极显著(P<0.01)，60Co-γ辐射对苜蓿叶片和根部过氧化物酶的积累产生显著的影响。

图4 60Co-γ辐射苜蓿种子的幼苗的叶片和根过氧化物酶活性的变化Fig.4 Changes of peroxidase activity in leaves and roots of seedling of alfalfa under 60Co-γ radiation

2.2.2过氧化氢酶活性的影响 在不同剂量60Co-γ射线辐射下的苜蓿种子，其幼苗叶片和根的CAT活性的变化见图4，苜蓿叶片和根的CAT活性随着辐射剂量的增加呈先上升后下降的趋势，辐射剂量900 Gy时苜蓿叶片和根CAT活性达到最大值，分别为382.22 U·g-1Fw·min-1和203.33 U·g-1Fw·min-1。在600、900、1 200和1 500 Gy60Co-γ 辐照剂量的叶片CAT活性分别比对照组增加19.13%、174.11%、67.74%和0.20%，根CAT活性分别比对照组增加13.58%、54.18%、20.22%和17.53%。苜蓿叶片CAT活性的方差分析显示，900和1 200 Gy辐射组与对照组和其他辐射组比较差异达到极显著水平(P<0.01)；苜蓿根CAT活性的方差分析显示，900 Gy辐射组与对照组和其他辐射组比较差异达到极显著水平(P<0.01)，一定的辐射剂量可以提高苜蓿叶片和根的CAT酶活性。

图4 60Co-γ辐射苜蓿种子的幼苗的叶片和根过氧化氢酶活性的变化Fig.4 Changes of catalase activity in leaves and roots of seedling of alfalfa under 60Co-γ radiation

3 讨论

60Co-γ射线可对植物的生长发育产生一定的抑制或促进作用，不同辐照剂量对不同植物的影响不同[3]。幼苗的生长发育上的变化是辐射诱变效应的重要参考指标，直接反映在M1代植株的存活率与生长对辐射的敏感性上。试验通过测定不同剂量60Co-γ辐射下，苜蓿干种子幼苗的出苗率、成苗率、鲜重、干重、主根长、苗长等指标变化，综合分析不同剂量的60Co-γ射线对植株生长发育的影响。苜蓿幼苗的出苗率、成苗率、幼苗的长度和地上茎长度均呈先上升后下降的趋势，主根长度、鲜重和干重呈现下降的趋势，且随着诱变剂量的增高，根逐渐变得短粗。由于高剂量的苜蓿干种子出苗后真叶未能长出，植株未能正常生长而死亡，这可能是因为种子经60Co-γ射线辐射后，能量在种子中沉积，导致种子受到不同程度的损伤，使胚中分生组织的分裂过程受到抑制，但对生长过程影响不大，所以种子能正常发芽，但在生长过程中会逐渐显现，最后导致幼苗死亡。试验中高辐射剂量1 800 Gy下的种子虽然出苗率达到49%，但是成苗率为0，与耿兴敏[4]研究60Co-γ辐射对桂花种子幼苗生长的影响，高剂量种子的幼苗的成苗率为0的结果一致。幼苗的长度在低剂量辐射下可以促进幼苗的生长，800～1 500 Gy高剂量的辐射抑制幼苗的生长，与袁蒲英[5]研究60Co-γ射线辐射对蜡梅种子幼苗生长的影响和林仙淋[6]研究60Co-γ辐射对多花野牡丹幼苗生长发育的影响结果一致。60Co-γ辐射不同剂量处理苜蓿种子的幼苗的鲜质量和干质量均呈下降的趋势，即辐射剂量越高幼苗的鲜质量和干质量越低，与李胜洪[7]研究60Co-γ辐射处理对紫花苜蓿部分生长的影响研究结果一致。

植物为适应辐照过后带来的损害，而产生适应机制使植物免受逆境的伤害，也即是植物体内存在的抗氧化酶系统包括过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等缓解因逆境带来的伤害[8]。不同的酶对辐照诱导存在各自不同的调节机制。本研究在供试剂量范围内，所检测的2种酶活性表达水平较对照整体呈先上升后下降趋势，但各种酶活性的变化情况又不完全相同。POD是细胞的呼吸代谢过程中一个重要的末端氧化酶，参与清除植物体内的 H2O2。随着辐射剂量的增加，苜蓿的叶片和主根部分的过氧化物酶活性均呈先上升后下降的趋势，均在辐射剂量为900 Gy时达到最大值，苜蓿的叶片与主根相比较，其叶片POD的酶活性积累大于主根。CAT酶是生物体内的主要抗氧化酶，它能促进细胞中过氧化氢的分解，减轻过氧化氢对细胞的损害。辐照后的苜蓿的叶片和主根中 CAT活性随剂量加大表现出先升高后降低的变化趋势，900 Gy时存在峰值，这与王月华[9]利用5种不同剂量的60Co-γ射线辐射处理草地早熟禾，对其体内酶活性的影响表现为先升高后降低的趋势一致。也和张玉[10]研究不同剂量60Co-γ射线辐射处理菊苣，其酶活性表现为随着辐射剂量的升高表现出先升高后降低趋势的结果一致。苜蓿叶片和主根比较，其叶片的CAT活性高于主根。CAT活性比POD活性的波动大，在消除过量的 H2O2方面起着主要的作用。不同辐射剂量对苜蓿产生的诱变效应不一致，其中的机制较为复杂，有待进一步研究。

4 结论

经过600，900，1 200，1 500和1 800 Gy辐射剂量处理的苜蓿种子，在种子的出苗率、成苗率、幼苗长度和地上茎长度均随着辐射剂量的增加呈下降的趋势，幼苗的主根长度、鲜重、干重和含水量均随着辐射剂量的增加呈下降的趋势；幼苗的叶片和根的POD、CAT活性均随随着辐射剂量的增加呈先上升后下降的趋势。60Co-γ射线辐射不同剂量对苜蓿幼苗生长表现为低剂量影响比较小，高剂量对幼苗的生长抑制作用比较大，对POD、CAT两种抗氧化酶活性积累产生不同的影响。