种植密度对紫花苜蓿不同生育时期叶片C、N、P生态化学计量的影响
2018-07-30刘文兰师尚礼田福平罗永忠
刘文兰， 师尚礼， 田福平， 罗永忠
(1. 甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070； 2. 草业生态系统教育部重点实验室 中—美草地畜牧业可持续发展研究中心 甘肃省草业工程实验室，甘肃 兰州 730070； 3. 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业部兰州黄土高原生态环境重点野外科学观测试验站，甘肃 兰州 730050； 4. 甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070)
在苜蓿(MedicagosatialL.)需求量日益增长且存在很大缺口的前提下，如何提高苜蓿产量、改善其品质成为亟待解决的问题。种植密度是制约植物群落生物量、生产力及养分循环最重要的因素之一[1]。种群密度的变化往往会改变植物的形态结构和体内养分的源-库关系[2]，以适应环境资源和种群竞争的变化，对植物的生物量、产量和养分元素贮量等产生重要的影响。关于种植密度对苜蓿影响的研究多从叶生产量[3]、生长发育[4-6]、草生产量[4-5,7-9]、种子产量[8,10]等方面进行，而且多限于苜蓿整株研究。由于紫花苜蓿不同部位叶片营养物质含量差异显著[11-16]，实际生产中可利用这种特性分层收获以获得不同利用价值的苜蓿产品，而且苜蓿分层收获方法在技术上已经实现[17]。孙启忠等[11]、王涵等[12]、徐春明等[13]、杨朝等[14-16]已经从分层的角度对苜蓿生物量、营养物质含量、生长特性进行了研究。
生态化学计量学是研究生物系统能量平衡和多重化学元素(主要是C、N、P)平衡的科学，主要强调的是活有机体的C、N、P主要组成元素的关系[18-20]。C是构成植物体内干物质的最主要元素，而N和P是各种蛋白质和遗传物质的重要组成元素。C∶N和C∶P反映了植物生长速度，并与植物对N和P的利用效率有关，而N∶P常作为对生产力起限制性作用的营养元素的指示剂。因此，生态化学计量学的提出为探究植物生长与养分供应的关系提供了有效手段[18,21-22]。关于种植密度对植物生态化学计量方面的研究多见于玉米(Corn)[23]、缺苞箭竹(Fargesiadenudata)[24-25]和四季竹(Oligostachyumlubricum)[1]，紫花苜蓿方面的研究较少。李丽等[26]认为苜蓿各器官氮素积累量随着施氮量的增大及密度的减小而不断增大。
因此，本论文以紫花苜蓿品种‘甘农3号’为试验材料，设置不同的种植密度分层研究各生育时期紫花苜蓿叶片C、N、P含量及其计量比变化规律，进而确定最适种植密度，为进行紫花苜蓿群体结构优化设计、发挥紫花苜蓿群体和个体效应的最大潜能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
试验在中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所甘肃兰州七里河区大洼山综合试验站进行。该试验站地理位置E 103°45′，N 36°01′，距离兰州市中心南侧 7.5 km处，属于兰州盆地黄河南岸三级阶地，土质为Ⅲ级自重湿陷性黄土。平均海拔1 700 m，降水量 250～350 mm，平均降水天数75 d左右；年均温9.3℃，极端最高温39.1℃，最低温-23.1℃，年日照时数2 751.4 h。试验地虽已耕作种植多年，但土壤较贫瘠，有机质含量 3.49 g·kg-1，全氮含量0.47 g·kg-1，碱解氮14.94 mg·kg-1，速效磷7.37 mg·kg-1，速效钾101.29 mg·kg-1，pH 7.90。
1.2 试验设计
以紫花苜蓿‘甘农3号’为材料，按照随机区组试验设计，设置5个种植密度：210，263，315，368，420万株·hm-2，分别记为D1，D2，D3，D4，D5。每个水平3次重复，共设置15个小区。小区面积7.5 m2(2.5 m×3 m)，各小区间距设置0.5 m。2014年5月30日播种，采用人工开沟条播，播种深度为 2 cm，行距为 30 cm。种子由草业生态系统教育部重点实验室提供。肥料在播种前一次性施入，尿素开沟2 cm 施入。每小区施用尿素(N 46.4%)和硫酸钾(K2O 50%)用量均分别为150 kg·hm-2和75 kg·hm-2，统一进行除草、灌水管理。试验于2015年第一茬分枝期(4月28日)、现蕾期(5月5日)、初花期(6月6日)进行。
1.3 指标测定
1.3.1叶片分层 分别在分枝期、现蕾期、初花期取样，每小区取2个1 m×1 m样方，留茬5 cm刈割，草样装入黑塑料袋带回实验室。刈割部分从下到上以植株第3茎节及以下作为下层，第4茎节至第6茎节作为中层，第7茎节及以上作为上层，用剪刀从两个分层茎节的中间剪下，茎叶分离。将待测叶片先在室内自然风干3 d，然后将其装入信封袋置于70℃烘箱中烘干至恒重，并用粉碎机粉碎后装入牛皮纸信封袋备用。
1.3.2叶片C、N、P含量测定 叶片有机碳采用重铬酸钾容量法测定，全氮采用自动凯氏定氮仪测定，全磷采用钼锑抗比色法[26]测定。
1.4 数据分析
紫花苜蓿叶片C、N、P化学计量比用质量比表示。用Microsoft Excel 2007进行数据整理和绘制图表，用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，显著性水平设定为α=0.05。
2 结果与分析
2.1 种植密度对叶片C、N、P含量的影响
2.1.1对叶片C含量的影响 由图1可知，随着植株密度的增大，紫花苜蓿同一生育时期叶片C含量总体呈下降趋势；随着紫花苜蓿植株生长发育的进行，相同密度处理下紫花苜蓿各层叶片C含量的大小顺序均为分枝期>现蕾期>初花期。同一生育时期相同种植密度下，各层叶片C含量的大小顺序为上层>中层>下层。这说明随着苜蓿植株成熟度的进行，成熟叶片的C含量低于幼嫩叶片的C含量；也说明种植密度增大使植株拥挤，叶片透光率下降明显[1]，净光合速率下降，C含量降低。
在分枝期的平均和中层叶片中，D1处理下的C含量显著高于于D3～D5处理，上层和下层叶片中D1密度与D4、D5密度差异显著。现蕾期C含量变化与分枝期相似，只是平均叶片中D2处理下的C含量也显著低于D1处理。对初花期的平均叶片而言，D1密度与D3～D5密度差异显著，上层叶片中D1处理和D5处理有显著差异，中层和下层中D1处理下的C含量显著高于于D4和D5处理。这说明不同生育时期各层叶片中D1处理下的C含量均显著高于D5处理。
以D1为对照，在D4处理下，分枝期上、中、下各层叶片C含量的降幅分别为2%，4%，2%，现蕾期为2%，3%，3%，初花期为2%，3%，2%；在最大密度D5下，分枝期上、中、下各层的降幅分别为4%，5%，3%，现蕾期为4%，4%，4%，初花期为4%，4%，4%。这说明种植密度对中层叶片C含量的影响大于上层和下层叶片。
图1 不同种植密度处理下各生育时期紫花苜蓿叶片C含量变化Fig.1 Change of C concentration in alfalfa leaf among different plant densities with different growth stages注：不同大写字母表示同一密度处理下各生育时期差异显著(P<0.05)；不同小写字母表示不同密度处理下同一生育时期叶片差异显著(P<0.05)，下同Note: Different capital letters indicate significant differences among growth stages under the same density at the 0.05 level; different small letters indicate significant differences among different densities with the same growth stages at the 0.05 level.The same as below
2.1.2对叶片N含量的影响 由图2可知，随着种植密度的增大，同一生育时期紫花苜蓿叶片N含量呈现下降趋势；随着紫花苜蓿植株成熟度的推进，相同密度处理下紫花苜蓿各层叶片N含量的大小顺序均为分枝期>现蕾期>初花期。同一生育时期相同种植密度下，各层叶片N含量的大小顺序为上层>中层>下层。
在分枝期，上层D1处理下叶片N含量与D4、D5处理差异显著(P<0.05)，其他层各处理间无显著差异。现蕾期平均叶片N含量D1密度与D4、D5密度有显著差异；对上层叶片而言，D1处理下叶片N含量显著大于D5处理；中层和下层各处理间无显著差异。在初花期的平均、上层和中层叶片中，D1处理下的N含量显著高于D5处理，下层各密度间无显著差异。总体来看，在上层叶片中，不同生育时期D1处理下N含量与D5处理差异显著(P<0.05)。
以D1为对照，在D4处理下，分枝期上、中、下各层叶片N含量的降幅分别为12%，13%，6%，现蕾期为4%，5%，8%，初花期为5%，9%，9%；在D5处理下，分枝期上、中、下各层的降幅分别为13%，13%，8%，现蕾期为7%，9%，11%，初花期为23%，15%，11%。这说明D5处理下上层叶片中的N含量在初花期降幅极为明显。
图2 不同种植密度处理下各生育时期紫花苜蓿叶片N含量变化Fig.2 Change of N concentration in alfalfa leaf among different planting densities with different growth stages
2.1.3对叶片P含量的影响 由图3可知，随着植株密度的增大，紫花苜蓿同一生育时期平均、各层叶片P含量均呈下降趋势；随着紫花苜蓿植株生长发育的进行，相同密度处理下紫花苜蓿各层P含量的大小顺序均为分枝期>现蕾期>初花期，且初花期叶片P含量与分枝期、现蕾期差异显著(P<0.05)。同一生育时期相同种植密度下，各层叶片P含量的大小顺序为上层>中层>下层。
在分枝期的平均叶片中，D1处理下的P含量显著高于其他各处理；在上层和中层叶片中，D1密度处理显著高于D4、D5密度处理，下层各密度处理间无显著差异。现蕾期的平均叶片中D1处理下的P含量与D3～D5处理有显著差异；对上层叶片而言，D1密度处理显著大于D4、D5密度处理；中层和下层叶片N含量各处理间无显著差异。在初花期的平均和中层叶片中，D1处理与其他各处理差异显著，上层和下层叶片中D1密度处理显著高于D3～D5密度。这说明植株密度对初花期的P含量的影响较大，且各层D1处理下的P含量与D3～D5处理差异显著。
以D1为对照，在D4密度下，分枝期上、中、下各层叶片P含量的降幅分别为9%，6%，4%，现蕾期为7%，6%，4%，初花期为15%，29%，34%；在最大密度D5下，分枝期上、中、下各层的降幅分别为10%，7%，5%，现蕾期为9%，7%，5%，初花期为19%，35%，20%。这说明种植密度对初花期叶片的影响较大，尤其对初花期中层叶片的影响更大。
图3 不同种植密度处理下各生育时期紫花苜蓿叶片P含量变化Fig.3 Change of P concentration in alfalfa leaf at the among different planting densities with different growth stages
2.2 种植密度对叶片化学计量比的影响
2.2.1对叶片C∶N的影响 由图4可知，随着种植密度的增大，同一生育时期紫花苜蓿叶片C∶N均呈升高趋势；不同生育时期，相同密度下紫花苜蓿各层叶片的C∶N大小顺序为初花期>现蕾期>分枝期。同一生育时期相同植株密度下，不同层叶片C∶N的大小顺序为下层>中层>上层。
在分枝期的平均、中层和下层叶片C∶N中，各密度处理间无显著差异，上层中D1处理下的C∶N显著低于D4处理。现蕾期各密度间无明显差异。对初花期的平均和上层叶片而言，D5处理下的C∶N显著高于其他处理，中层叶片中D5密度与D1密度差异显著，下层叶片中各密度间差异不显著，说明植株密度对初花期的叶片C∶N影响较大。
2.2.2对叶片C∶P的影响 由图5可知，随着种植密度的增大，同一生育时期紫花苜蓿平均和各层叶片C∶P呈升高趋势；随着紫花苜蓿植株生长发育的进行，相同密度各层叶片的C∶P大小顺序为初花期>现蕾期>分枝期，且初花期显著高于分枝期和现蕾期。同一生育时期相同种植密度下，叶片C∶P的大小顺序为下层>中层>上层。
对分枝期的平均叶片C∶P来说，D1处理与D3～D5处理差异显著，上、中、下3层中各密度间均无显著差异。现蕾期各密度间差异不显著。在初花期的平均、中层和下层叶片中，D4和D5处理下的C∶P显著高于其他处理，上层叶片中各密度间无显著差异，说明植株密度对初花期的叶片C∶P影响较大。
图4 不同种植密度处理下各生育时期紫花苜蓿叶片C∶N变化Fig.4 Change of C∶N in alfalfa leaf among different planting densities with different growth stages
图5 不同种植密度处理下各生育时期紫花苜蓿叶片C∶P变化Fig.5 Change of C∶P in alfalfa leaf among different planting densities with different growth stages
2.2.3对叶片N∶P的影响 由图6可知，随着种植密度的增大，同一生育时期紫花苜蓿平均、各层叶片N∶P表现不尽相同。在分枝期，平均和各层叶片N∶P随着植株密度的增大呈现下降的趋势，且各处理间无显著差异。在现蕾期，随着密度的增大，平均和中层叶片N∶P呈先下降后升高的趋势，上层呈升高趋势，下层呈下降的趋势，但密度间均无显著差异。初花期平均和各层叶片N∶P均呈增大趋势；在平均叶片中，D4密度处理和D1、D2密度处理差异显著，上层各密度间处理无明显差异，中层D5处理下的N∶P显著高于D1和D2处理，下层中D4和D5处理与D1和D2处理均差异显著。
同一生育时期相同种植密度下，各层叶片N∶P大小表现为上层>中层>下层。同一种植密度下，初花期叶片N∶P均大于分枝期、现蕾期。
图6 不同种植密度处理下各生育时期紫花苜蓿叶片N∶P变化Fig.6 Change of N∶P in alfalfa leaf among different planting densities with different growth stages
2.3 各指标与种植密度的相关性
2.3.1分枝期各指标与种植密度的相关性 通过对不同种植密度下分枝期苜蓿叶片C、N、P含量及其计量比的相关分析可以看出(表1)，种植密度与平均叶片C、P含量呈极显著负相关，与N含量呈显著负相关，与C∶P呈极显著正相关，与C∶N、N∶P无显著相关性。在上层叶片中，种植密度与C、N、P含量呈极显著负相关，与C∶N、C∶P呈显著正相关；在中层叶片中，种植密度与C、P含量呈极显著负相关，与N含量呈负相关，但相关性不显著；对下层叶片，种植密度与C含量呈极显著负相关，与P含量呈显著负相关。总体来看，叶片C含量对密度处理较为敏感，尤其是中层叶片。
表1 分枝期种植密度与各指标之间的相关性Table 1 Correlations between nutrient concentrations and planting densities in branching stage
注：**表示极显著相关(P<0.01)，*表示显著相关(P<0.05)，下同
Note：**indicates significant correlation at the 0.01 level，*indicates significant correlation at the 0.05 level. The same as below
2.3.2现蕾期各指标与种植密度的相关性 表2说明，种植密度与平均叶片C、N、P含量呈极显著负相关，与C∶P呈显著正相关。在上层叶片中，种植密度与C、N、P含量呈极显著负相关，与C∶P呈显著正相关；对于中层叶片，种植密度与C含量呈极显著负相关，与P含量呈显著负相关；在下层叶片中，种植密度与C含量呈极显著负相关，与其它指标相关性均不显著。这说明现蕾期叶片C含量对密度处理最为敏感，其次为P含量。
表2 现蕾期各指标与种植密度之间的相关性Table 2 Correlations between nutrient concentrations and planting densities in bud stage
2.3.3初花期各指标与种植密度的相关性 由表3可知，种植密度与平均叶片C、N、P含量呈极显著负相关，与C∶N、C∶P呈极显著正相关，与N∶P呈显著正相关。对于上层叶片，种植密度与C、N、P含量呈极显著负相关，且与P含量的相关性更密切，与C∶N、C∶P呈极显著正相关；在中层叶片中，种植密度与叶片C、N、P含量呈极显著负相关，与叶片C∶P、N∶P呈极显著正相关，与C∶N呈显著正相关；下层叶片的种植密度与C、P含量呈极显著负相关，与C∶P及N∶P呈极显著正相关。由此可见，叶片P含量对密度处理较为敏感，尤其是中层叶片。
表3 初花期各指标与种植密度之间的相关性Table 3 Correlations between nutrient concentrations and planting densities in early flowering stage
3 讨 论
3.1 种植密度对叶片C、N、P含量的影响
植物为适应环境条件的变化，具有调整营养元素化学计量特征的能力[27-28]。本研究结果表明，随着植株密度的增加，不同生育时期紫花苜蓿叶片的C、N、P含量均降低，这与吴福忠等[25]对高山地区缺苞箭竹和郭子武等[1]对四季竹的研究结果一致。本研究也表明，同一生育时期相同种植密度下，各层叶片的C、N、P含量的大小顺序为上层>中层>下层。这些均说明在强光照或中、低密度条件下，紫花苜蓿能够维持较高的光合同化产物量，来扩大种群密度，拓展生存空间[1]，但在弱光照或高种植密度下，透光率下降，个体间竞争加剧，受生存空间及主要环境资源生物有效性和可获得性降低等的限制，叶片光合固C能力明显减弱；而N、P含量的降低可能一方面是由于紫花苜蓿密度增大对土壤速效养分需求量的增多导致土壤养分的可获得性降低[1]，另一方面是植物为维持自身生长N、P养分需转移至中层和上层，从而引起养分吸收限制和获取量的下降，并最终导致下层的N、P含量为最低。同一密度不同生育时期各层叶片C、N、P含量大小顺序均为分枝期>现蕾期>初花期，这与孙启忠等[11]对敖汉苜蓿的研究结果一致。种植密度对紫花苜蓿中层叶片的C、P含量影响大于上层和下层，对上层叶片的N含量影响大于中层和下层；对初花期叶片N、P含量的影响大于现蕾期叶片，说明中层叶片对种植密度的敏感性高于上、下层叶片，初花期叶片对种植密度的敏感性高于分枝期和现蕾期叶片。从紫花苜蓿叶片C、N、P含量随密度的变化分析，D5密度的环境资源限制已影响到紫花苜蓿的更新生长。
3.2 种植密度对叶片C、N、P计量比的影响
植物叶片的C∶N和C∶P在一定程度上反映了植物的养分利用效率，因而具有重要的生态学意义[18,29]。本研究表明，随着种植密度的增大，不同生育时期紫花苜蓿叶片的C∶N、C∶P均呈升高趋势，说明N、P利用效率随密度的增大而提高，这在一定程度上缓解了密度过高所造成的叶片养分降低对紫花苜蓿个体生长和种群扩张的限制[1]。本研究还表明，同一种植密度下相同生育时期各层叶片C∶N和C∶P大小表现为下层>中层>上层，同一种植密度处理的上、中、下3层叶片C∶N和C∶P大小顺序为初花期>现蕾期>分枝期。这说明在密度增大过程中，由于C在植物体内含量很高，变异较小，因此N、P含量变化是影响C∶N、C∶P的主要因素。增大种植密度，叶片的C、N、P含量均降低，尤其是下层叶片的C、N、P含量降低显著，但C含量的降低幅度低于N、P含量，所以C∶N、C∶P呈升高趋势，且下层>中层>上层。增大种植密度，叶片N∶P在分枝期的上、中、下3层均呈下降趋势；在现蕾期的上层呈上升趋势，在中层呈先下降后升高的趋势，下层呈下降趋势；在初花期的各层均呈升高趋势。这说明紫花苜蓿N、P养分限制格局被迫发生改变[29,31-32]，也体现了紫花苜蓿为适应高密度生境，通过对叶片N、P化学计量比变化进行自我调节。这与郭子武等[1]对四季竹N、P化学计量特征变化机制的假设相符。
植物叶片N∶P被广泛应用于植物对生产力供给的限制性诊断[30]。不同密度处理下紫花苜蓿叶片N∶P的变化，可能与密度变化导致林内环境资源、可利用性及干扰竞争等一系列变化有关。依据Koerselman和Meuleman[33]对N∶P的研究结果判断，N∶P<14，受N限制, 14
从紫花苜蓿不同密度处理下叶片C∶N、C∶P、N∶P变化可知，D4、D5密度的N、P养分利用率高，但D5密度的C同化能力弱，说明D4密度为紫花苜蓿良好生长的适宜种植密度。
4 结论
随种植密度的增大，同一生育时期紫花苜蓿上、中、下3层及平均叶片C、N、P含量总体呈下降趋势，而叶片C∶N和C∶P升高，N∶P则表现不尽相同，分枝期和现蕾期的叶片C含量及初花期的叶片P含量对密度处理较为敏感；随着紫花苜蓿生育期的推进，相同密度下紫花苜蓿各层叶片C、N、P含量的大小顺序均为分枝期>现蕾期>初花期，C∶N和C∶P为初花期>现蕾期>分枝期；同一生育时期相同种植密度下，叶片C、N、P含量及N∶P的大小顺序为上层>中层>下层，C∶N和C∶P为下层>中层>上层。
分枝期和现蕾期紫花苜蓿平均叶片N∶P均介于11～12之间，这2个时期紫花苜蓿均受N限制；初花期N∶P介于11～15之间，紫花苜蓿受N、P共同限制。
综合考虑紫花苜蓿平均及上、中、下3层叶片化学计量关系，紫花苜蓿适宜的种植密度为368 万株·hm-2。
