酶解法与HPLC法相结合检测金钱草胶囊在人体内药代动力学

暨南大学医学院第二附属医院/深圳市人民医院，广东 深圳 518040

金钱草也被成为神仙对坐草、地蜈蚣，其味酸、苦，可供药用，有清热利尿、消炎解毒、杀虫之功[1]。金钱草胶囊是当前临床上使用新鲜或干燥金钱草作为原料的中药制剂，其主要有效成分为槲皮素[2]。现代药理研究证实，金钱草胶囊在肝胆和泌尿系统结石、湿热黄疸、肾炎水肿以及跌打损伤治疗中均具有较好效果[3]。因为该药物为中药制剂，不良反应较少，因此在临床上应用越来越广泛。当前临床上主要采用高效液相色谱-紫外检测方法对药物中槲皮素及其在人体中药代动力学情况进行测定[4]。为进一步探究金钱草胶囊在人体内药代动力学，本研究先使用酶解法获得其有效成分游离槲皮素苷元，之后再使用高效液相色谱法对血药浓度进行检测。

1 资料与方法

1.1 受试者选择 15名健康男性志愿者，体质量63～73 kg，平均体重(62.1±6.9)kg；年龄20～29岁，平均年龄(25.2±1. 4)岁；身高160～172 cm，平均身高(167.5±4.1)cm；志愿者的年龄、体重等基本资料均在标准范围内。纳入标准：不吸烟，不嗜酒，身体健康；无心、肝、肾、肺、消化道系统等疾病史；精神状态正常；体检及实验室检查结果均正常；无金钱草胶囊等药物过敏史；试验前2周及试验期间未使用任何药物。所有志愿者均签署知情同意书，自愿参加此次研究，且该研究获我院伦理委员会批准。

1.2 试验方案 志愿者于试验前1日和试验期内禁止吸烟和饮用酒类、咖啡类或果汁饮料；试验前1 日晚17：00统一标准晚餐，禁食12 h。次日早晨空腹单次口服金钱草胶囊1.6 g，用200 mL温开水吞服；服药2 h 后方可再饮水、统一进食标准餐。分别于给药前及给药后0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 肘静脉取血4 mL，置于干燥管中，静止30 min，10000 r/min离心10 min，取上清液置-75℃冰箱中做好标记保存。

1.3 槲皮素对照品溶液配制 精密称取槲皮素对照品10 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得质量浓度为400 μg/mL的槲皮素对照品贮备液，置4 ℃冰箱中备用。

1.4 血浆样品的提取与分离 将血浆样品于室温解冻后，精密量取志愿者血浆样品0.5 mL置于离心管中，0.58 mol·L-1冰醋酸20 μL 和10 kU·mL-1β-葡萄糖醛酸苷酶液20 μL，将PH调至4.5～5.0，旋涡30 s混匀后，37 ℃水浴30 min，水解完毕后，加入对照品槲皮素溶液10 μL，旋涡振荡5 min，10 000 r/min离心10 min，吸取上清液，50 ℃水浴氮气流吹干，0.8 mL甲醇溶解残渣，旋涡振荡30 s，10 000 r/min离心3 min，进样量20 μL进行测定。

1.5 统计分析 采用DAS ver 2.1.1软件对志愿者不同时间的血药浓度数据进行分析并计算各药代动力学参数，梯形法计算AUC。

2 结果

2.1 酶解条件 血浆样品处理过程分别加入320、160、80、40、20、10、5、4、3、2、1 kU·mL-1不同浓度配制的β-葡萄糖醛酸苷酶液20 μL，结果显示当酶浓度为10 kU·mL-1时水解效率最高。另考察了酶解时间30 min 达到峰值。

2.2 精密度与准确度 制备含槲皮素对照品溶液配制质量浓度分别为0.16、2.40、8.00 μg/mL的3种含药血浆质控样品，每批每个浓度各5份，按“血浆样品的提取与分离”项下方法操作，连续做6 d，并且在1 d内重复测定6次，记录槲皮素峰面积，实测浓度计算日内、日间精密度及回收率，见表1。

表1 精密度、准确度与回收率结果

2.3 人体内药代动力学研究 15名健康男性志愿者口服1.6 g金钱草胶囊后，金钱草胶囊的平均血药浓度-时间曲线见图1，主要药代动力学参数见表2。

表2 口服1.6 g金钱草胶囊人体内药代动力学参数

3 讨论

金钱草胶囊以中药金钱草作为原材料，其主要有效成分为槲皮素。槲皮素为多羟基黄酮类化合物，其主要存在形式为苷元[5-7]。为了探讨金钱草胶囊的药代动力学情况，笔者使用酶解法与高效液相色谱相结合的方法对药物中主要有效成分进行血药浓度测定。

槲皮素在经人体胃肠道吸收并且进入血液后往往与血液中其他成分相结合，因此若要对游离槲皮素进行检测必须对其进行水解处理[8-9]。以往实验在对槲皮素进行水解时往往采用酸水解，但是该方法却需要加热回流因此对于样本量较少的研究不太适用。本研究中采用酶解法对金钱草胶囊中槲皮素进行分离萃取，通过对水解条件、试剂以及提取方式等进行优化取得了较好的效果。使用β-葡萄糖醛酸苷酶液对槲皮素进行分离能够有效提取苷元。本研究在血浆样本中加入不同浓度的β-葡萄糖醛酸苷酶液后发现当酶浓度在10 kU·mL-1时水解效率最高。对于分离金钱草胶囊中有效成分的水解条件给了很好的启示。血浆样本的色谱峰具备较好的分离度，同时，检测的精密度和准确性均能够符合药代动力学检测的要求。同时本研究还对酶解的条件问题进行了考察，结果显示，当酶浓度为10 kU·mL-1时水解效率最高，并且在酶解时间30 min时达到峰值。

另外本研究显示，15名受试者在口服金钱草胶囊后其体内槲皮素苷元的Tmax存在较大波动，同时还有5名患者存在双峰现象，这样进一步提示肝肠循环可能也参与了金钱草胶囊在人体内胃肠道吸收的过程。另外，受个体差异的影响，β-葡萄糖醛酸苷酶在不同人体内活性也存在较大差异，这也是造成Cmax与AUC存在较大差异的原因。

综上，本研究结果显示，酶解法联合高效液相色谱法能够有效对金钱草胶囊制剂的生物学特性以及药代动力学情况进行有效分析，为今后药学研究以及临床更加合理使用药物提供了参考。