RAGE基因多态性与冠状动脉狭窄程度相关性研究

胡静涛，李艳茹

作者单位：1 462300 漯河,河南省漯河医学高等专科学校第二附属医院心内科

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病，CHD）是冠状动脉内膜脂质大量堆积形成斑块引发的一种严重危害人类身体健康和生活质量的动脉粥样硬化性病变，其发病率和致死率一直居高不下，被称为威胁人类健康的“第一杀手”[1]。因此，对于防治CHD的发生和发展是一项长期且艰巨的任务。迄今为止，CHD的相关机制尚待探讨，但是动脉粥样硬化（AS）引发的慢性炎症反应被普遍认为是大多数心血管疾病的发病基础[2]。晚期糖基化终产物受体（RAGE）在引起炎症反应和氧化应激方面发挥着重要作用[3]。RAGE通过与晚期糖基化终产物，S100/钙粒蛋白等多种相关配体结合，刺激细胞因子和炎性因子释放，导致血管通透性异常，损伤血管内皮功能，从而引发AS的发生[4]。近几年，随着医学水平的发展，从遗传学角度探讨基因突变与CHD发病机制的相关性已经成为心血管领域的研究热点，但是目前为止，尚没有发现某个基因突变与CHD的发生和预后密切相关。考虑到RAGE特殊的结构特征，在启动子区域、外显子和内含子均存在众多的单核苷酸多态性（SNPs），从而调控RAGE参与不同的信号通路促使动脉粥样硬化的加速损伤[5]。但是目前国外关于RAGE基因多态性与CHD发病和严重程度的相关性研究尚少且存在一定的争议性，本项研究旨在探讨RAGE基因多态性与我国汉族人群冠状动脉狭窄程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 入组患者 本项研究回顾性分析了2016年1月～2017年10月于漯河医学高等专科学校第二附属医院心内科住院的397例CHD患者，其中男性238例，女性159例，年龄为39～81岁，平均年龄为（63.67±13.19）岁。所有患者经冠状动脉造影确诊为CHD，并根据造影结果分为冠状动脉轻中度狭窄（管径狭窄＜75%）组（n=185例）和重度狭窄（管径狭窄≥75%）组（n=212例）。另外，选取同时期在我院体检中心进行健康体检的正常志愿者48例，其中男性27例，女性21例，年龄为50～72岁，平均年龄为（62.28±12.74）岁。

1.2 入选标准

1.2.1 CHD患者 ①所有患者接受冠状动脉造影检查；②均符合《冠心病诊断与治疗指南（2014版）》关于CHD的诊断标准[6]；③患者自愿，并签署知情同意书。

1.2.2 非CHD受试者 ①经健康体检、实验室检查、心电图检查、胸片、核素心肌灌注显像、冠状动脉CT成像（CTA）排除CHD、高血压等心血管疾病；②无家族性高血压史、心脑血管疾病史；③签署知情同意书。

1.3 排除标准 ①不符合上述纳入标准的受试者；②合并恶性肿瘤者；③合并器质性心脏病变者；④合并有血液系统疾病、免疫系统疾病、内分泌疾病或者急性感染者；⑤合并其他严重疾病者。

1.4 样本采集 采集所有受试者清晨空腹时的外周静脉血5 ml，其中1 ml置于含有依地酸二钠（EDTA-Na）抗凝剂的采血管中，用于检测生化指标；其余血液样本于-70℃低温保存，用于进行DNA提取。

1.5 研究方法

1.5.1 生化指标检测 由漯河医学高等专科学校第二附属医院检验科采用迈瑞BS350全自动血液生化分析仪（中国迈瑞）检测患者血糖、血脂等生化指标。另外由心电图科室采用GE MAC1200心电图监护仪（美国通用公司）进行超声心动图检查，包括左室射血分数（LVEF），二尖瓣血流E峰和A峰流速比值（MVE/MVA），左心室收缩期内径（LVIDs），左心室舒张期内径（LVIDd）。

1.5.2 冠状动脉造影 由2位介入专家进行操作，并判断冠状动脉狭窄程度：左主干、左前降支、回旋支和右冠状动脉及主要分支中出现1支以上血管狭窄程度≥50%的情况。冠状动脉管径狭窄＜75%者为轻中度狭窄；管径狭窄≥75%为重度狭窄。

1.5.3 引物设计与合成方法 根据NCBI数据库获得的资料设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。RNGE启动子区、外显子和内含子基因SNPs分析（表1）。

1.5.4 RAGE基因多态性检测方法 ①DNA提取：采用基因组DNA小量抽提试剂盒（由北京天根生物技术有限公司提供）。具体提取方法参照说明书进行。②采用紫外分光光度法测定DNA质量和浓度。③进行PCR-RFLP：取8 μl PCR扩增产物，加入2 μl 10×Buffer和1ul特异性限制性内切酶（购自大连宝生生物工程有限公司），然后加入9 μl去离子水，于37℃反应12～14 h。④将PCR产物进行电泳检测。⑤基因测序：将50 μl测序样品送至上海生工生物工程有限公司进行纯化测序；确定为目的片段后，进行大批量扩增，电泳，酶切，确定基因型。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析处理。每一等位基因出现的频率采用直接计数法进行计算；计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验进行两组间的数据比较；计数资料以百分比表示，组间比较采用卡方检验。采用Logistic多元回归分析确定RAGE基因多态性与冠脉病变的关系。根据样本方差，采用相应的t值或P值；以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组受试者一般临床资料比较 经统计分析，三组受试者年龄、饮酒史、总胆固醇水平、LVEF、LVIDs、LVIDd比较无统计学差异，P＜0.05；但是有吸烟史、糖尿病史、阿司匹林服用史、降压药服用史的CHD患者比例明显高于非CHD受试者，有统计学差异，P＜0.05。另外，CHD患者收缩压、舒张压、三酰甘油、空腹血糖值明显高于非CHD受试者，有统计学差异，P＜0.05（表2）。

表1 RNGE启动子区、外显子和内含子基因SNPs分析

2.2 各组之间TNF-α-238基因型及等位基因分布频率比较 对照组受试者、冠脉狭窄轻中度组和重度组患者RAGE基因启动子区-429T/C多态性基因分布频率分别为（83.33%TT，14.58%TC，2.08%CC），（77.3%TT，22.7%TC），（74.53%TT，25.47%TC），其中以TT型为最多见。对照组受试者、冠脉狭窄轻中度组和重度组患者RAGE基因外显子区1704G/T多态性基因分布频率分别为（64.58%GG，29.17%GT，6.25%TT），（65.95%GG，27.03%GT，7.03%TT），（66.04%GG，29.72%GT，4.25%TT），其中以GG型为最多见。三组之间-429T/C和1704G/T多态性的基因型和等位基因频率分布无统计学差异，P＜0.05。对照组受试者、冠脉狭窄轻中度组和重度组患者RAGE基因内含子区G82S多态性基因分布频率分别为（75.0%GG，22.92%GS，2.08%SS），（62.7%GG，36.22%GS，1.08%SS），（52.83%GG，36.79%GS，10.38%SS），其中以GG型为最多见。等位基因频率分别为（87.5%G，12.5%S），（80.81%G，19.19%S），（71.93%G，28.07%S），其中以等位基因G为最多见。三组受试者中三种基因型及G、S等位基因的频率分布存在显著的统计学差异，P＜0.05（表3）。

2.3 各组受试者RAGE基因单倍体型分布频率 由RAGE基因-429T/C、1704G/T和G82S多态位点构建单倍体，经PHASE2.0软件检测，G-Gly-T、G-Gly-C、G-Ser-T、T-Gly-T四个单倍体频率＞5%。对照组受试者、冠脉狭窄轻中度组和重度组患者中这四对单倍体型的分布频率存在统计学差异，P＜0.05。其中对照组受试者G-Gly-T单倍体分布频率高于其他两组CHD患者，而重度冠脉狭窄组患者G-Ser-T单倍体分布频率高于其他两组，有统计学差异，P＜0.05（表4）。

表2 各组患者临床基线资料比较

表3 RNGE基因多态性基因型及等位基因频率分布（n，%）

2.4 RAGE基因单倍体型与冠状动脉狭窄程度的相关性 单倍体G-Ser-T与冠状动脉发生重度狭窄有明显的正相关性（OR值为1.984，95%CI为1.241～2.955，P=0.014＜0.05）。提示单倍体G-Ser-T可明显增加冠状动脉发生狭窄的风险，P＜0.05。未发现其他单倍体与冠状动脉狭窄存在相关性，P＜0.05（表5）。

3 讨论

目前，冠状动脉粥样硬化性心脏病已经成为全球性问题。进入本世纪以来，随着我国老龄化问题的日益严峻，冠心病的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁到国民尤其是老年人群的生命健康和生活质量。CHD的发病因素多样化，包括年龄、性别、饮酒史、糖尿病史等都是常见的危险因素[7]。本项研究也分析了影响CHD发生的相关因素，其中男性较女性发病率高，有吸烟史者、合并糖尿病、高血压者CHD的发病率升高。在我国通常将阿司匹林、钙离子阻滞剂、β受体拮抗剂、他汀类降压药物等作为CHD的二级预防方案。但本项研究发现，未给予二级预防治疗的冠心病患者，其发病率并没有得到有效控制。

CHD的发病机制一直是心血管领域的研究重点，但是尚未明确；多项研究证实，由动脉粥样硬化引起的全身慢性炎症反应是CHD重要的发病基础之一[8]。RAGE作为免疫球蛋白超家族成员之一，与相关配体在炎症反应过程中发挥着重要作用，通过激活多种信号通路，激活核转录因子，促使炎性因子、粘附分子以及趋化因子的分泌增加，导致血管内皮发生炎症反应，损伤内皮功能和血管内皮的通透性，进一步影响脂质代谢，促使心肌细胞凋亡，从而引发心血管粥样硬化性病变[9,10]。因此RAGE基因一直被认为是心血管疾病遗传易感性的重要基因[11]。

近些年，随着分子生物学的发展，尤其是基因组计划和后基因组计划研究工作的深入开展，为探讨冠心病发生发展的遗传学机制提供了新的思路和方法。通过对相关基因多态性的研究，有可能为我们从基因水平上认识CHD的发病机制提供了新的依据。上个世纪末，由Hudson等[12]学者首次发现RAGE配体结合域存在功能性氨基酸变异现象，可激活配体产生炎症反应，从而认为RAGE基因关键区域的基因多态性可能会影响基因表达，进一步导致不同的作用反应[13]。有研究证实，RAGE G8S2突变位点与阿尔兹海默病、糖尿病视网膜病变、银屑病等多种疾病的遗传易感性密切相关[14,15]。基于前期报道，本项研究着重探讨了EAGE基因多态性与CHD患者冠脉病变程度的相关性。结果显示，携带有RAGE基因G82S多态性的单倍体型发生冠状动脉重度狭窄的危险性显著增加。其可能的作用机制与RAGE S等位基因的配体结合亲和力强于G等位基因有关，可进一步促使血管内皮发生氧化应激反应。但是，本项研究未发现，其他RAGE单倍体型与冠状动脉狭窄存在明显的相关性。这可能与种族、地域以及样本纳入量较少有关。

由于冠心病的发病机制十分复杂且与遗传因素密切相关，不同的种族、地区的人群基因背景也不甚相同，因此RAGE基因多态性在冠心病的发生以及发展过程中是否发挥重要作用，还尚待进一步确证。本研究在一定程度上反映了携带有RAGE基因G82S多态性的单倍体型人群发生冠状动脉重度狭窄的危险性显著增加，是发生冠脉严重狭窄的一项重要危险因素，为冠心病的预防和基因治疗提供了一定的证据支持。

表4 各组受试者RAGE基因单倍体型分布频率[n(%)]

表5 经Logistic多元回归分析RAGE基因单倍体型与冠状动脉狭窄程度的相关性