七氟醚不同麻醉时间对大鼠认知功能的影响及机制

罗思琴，方开云，蒋向平，刚绍鹏，何祥，蒋玲

(1贵州省人民医院，贵阳550002；2贵州医科大学)

术后认知功能障碍(POCD)是术后出现的一种中枢神经系统并发症，临床表现以记忆和集中力损害为主，可以持续数周至数年。有研究发现，麻醉是POCD发生的危险因素之一。七氟醚广泛应用于临床，然而关于七氟醚麻醉对认知功能影响的研究结果各不相同。动物实验显示，新生大鼠、成年大鼠以及老年大鼠吸入七氟醚均可引起认知功能损害[1～3]。我们的前期研究证实，吸入1%、3%、5%七氟醚1 h均可导致大鼠认知功能损害，海马神经元α7乙酰胆碱受体(α7-nAchR)的表达下调[4]。有研究表明，七氟醚对认知功能的影响与吸入浓度和时间相关[5]，而吸入相同浓度、不同时间七氟醚麻醉对成年大鼠认知功能的影响，目前鲜有报道。2016年6月～2017年5月，我们观察了吸入七氟醚不同时间对大鼠认知功能及海马神经元α7-nAchR表达的影响，为POCD的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 3～4月龄SD大鼠96只，雌雄各半，体质量220～270 g，由贵州医科大学实验动物中心提供。七氟醚(Abbvie公司，美国)。Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)，Ohmeda excel 110 SE型麻醉机(美国)，自动曝光仪(Bio-Rad，美国)，CFX ConnectTMReal-time PCR仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 动物分组与处理 采用随机数字表法将大鼠分为七氟醚1、2、3组和对照组各24只。对照组吸入空气，七氟醚1、2、3组分别吸入3%七氟醚1、3、5 h。麻醉方法：麻醉前禁食禁饮8 h，将大鼠置于60 cm×30 cm×25 cm的透明麻醉箱内。麻醉箱有两个侧孔，一侧孔连接麻醉机，用麻醉气体挥发罐控制麻醉气体输出浓度；另一侧孔连接气体监测仪监测流出气体中的七氟醚浓度。呼出七氟醚浓度维持在3%，调节氧流量为3 L/min。使用婴儿脉搏氧饱和度探头贴于大鼠腹部，监测血氧饱和度，每隔1 h采集鼠尾动脉血样，行血气分析，血氧饱和度及动脉血气分析结果维持在正常范围。对照组吸入空气，其他处理同实验组。麻醉结束后将各组大鼠放回鼠笼，待其苏醒1 h后进饮食。

1.3 大鼠学习和记忆能力观察 采用Morris水迷宫实验。用药前行定位航行实验训练各组大鼠的学习和记忆能力。共训练5 d，4次/d，上午9：00～12：00进行。将大鼠分别从4个象限入水点面向池壁放入水中，记录120 s内寻找到平台的时间(逃避潜伏期)并让大鼠在平台上停留10 s，超过120 s未能找到平台者，用木棒将其引上平台并在平台上停留10 s，其潜伏期计为120 s。每天4次测定结果的平均值作为逃避潜伏期。于第6天即麻醉前1 d进行空间探索实验，测试大鼠对平台空间位置记忆的能力。撤去平台，从目标象限的对称象限将大鼠面向槽壁放入水中，记录120 s内目标象限持续时间、目标象限路程、穿越平台次数，计算原平台所在象限时间占总时间比、原平台所在象限路程占总路程比。于麻醉后1、7 d每组取12只大鼠进行空间探索实验。

1.4 海马组织中α7-nAchR蛋白表达检测 采用Western blotting法。于麻醉后1、7 d水迷宫实验后，各组分别取12只大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取一侧海马组织，匀浆，加入裂解液进行研磨，离心取上清。采用BCA蛋白定量法制作标准曲线测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白质转至醋酸纤维素膜，加入8%脱脂奶粉封闭。加入α7-nAchR单克隆抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜。加入HRP标记抗大鼠IgG二抗(1∶5 000)室温孵育1 h。TBST洗涤，ECL发光液于自动曝光仪中进行曝光。采用Image J软件进行图像分析，以α7-nAchR蛋白条带灰度值与内参β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.5 海马组织中α7-nAchR mRNA表达检测 采用Real-time PCR法。取大鼠一侧海马组织匀浆，加入TRIzol液提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，β-actin为内参进行扩增。引物序列：α7-nAchR上游5′-ATGGTGGCAAAATGCCTAAG-3′，下游5′-CTCGGAAGCCAATGTAGAGC-3′，扩增片段长度204 bp；β-actin上游5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′，扩增片段长度207 bp。反应体系：α7-nAchR上下游引物各0.5 μL，SYBR Green荧光染料5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL，总体系10 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。PCR扩增结束后，使用荧光定量PCR仪采集待测基因及内参的荧光信号，记录Ct值，采用2-ΔΔCt法计算α7-nAchR mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 各组定位航行实验结果比较 各组定位航行实验逃避潜伏期均呈逐日缩短的趋势。七氟醚1、2、3组与对照组比较，逃避潜伏期无明显延长(P均>0.05)。见表1。

表1 各组逃避潜伏期比较

2.2 各组空间探索实验结果比较 与对照组比较，七氟醚1、2、3组麻醉后1 d穿越原平台次数、总路程差异无统计学意义(P均>0.05)，七氟醚1、2、3组麻醉后7 d穿越原平台次数、总路程、目标象限路程差异无统计学意义(P均>0.05)，七氟醚1、2、3组各时点目标象限持续时间缩短，原平台所在象限时间占总时间比、原平台所在象限路程占总路程比下降(P均<0.05)，七氟醚3组麻醉后1 d的目标象限路程缩短(P<0.05)；与七氟醚1组比较，七氟醚2组的以上指标差异无统计学意义(P均>0.05)；与七氟醚1、2组比较，七氟醚3组麻醉后1 d目标象限持续时间缩短，原平台所在象限时间占总时间比、原平台所在象限路程占总路程比下降(P均<0.05)。见表2。

表2 各组空间探索实验结果比较

注：与对照组同期比较，aP<0.05；与七氟醚1组同期比较，bP<0.05；与七氟醚2组同期比较，cP<0.05。

2.3 各组海马组织中α7-nAchR蛋白和mRNA表达比较 与对照组比较，七氟醚1、2、3组各时点α7-nAchR蛋白和mRNA表达下调(P均<0.05)；七氟醚1、2、3组各时点进行组间比较，α7-nAchR蛋白和mRNA表达呈下降趋势，但差异无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 各组海马组织中α7-nAchR蛋白和mRNA表达比较

注：与对照组同期比较，aP<0.05。

3 讨论

七氟醚广泛用于全身麻醉的诱导和维持，具有对循环和呼吸影响小、代谢快、恢复快、刺激性小的特点。在临床麻醉中，常选用的有效剂量为1.2～1.5 MAC。有报道称短小手术，腹部手术、骨科手术等较长时间、创伤较大的手术行七氟醚麻醉易导致POCD的发生。也有报道称七氟醚预处理、后处理可以减少POCD的发生。动物实验发现，吸入3%、5%的七氟醚会导致大鼠认知功能减退，表明吸入七氟醚麻醉对大鼠认知功能的影响与吸入的浓度有关。研究发现，吸入麻醉对认知功能影响与吸入时间有关，大鼠吸入七氟醚麻醉不同时间后，认知功能的改变具有时间相关性[6，7]。但目前吸入七氟醚麻醉对认知功能的影响尚不明确。

有研究报道，成年小鼠吸入七氟醚麻醉3 h可造成认知功能损害。李长生等[8]报道，给予成年小鼠、老年大鼠吸入3%七氟醚麻醉2、4 h均能损害其学习探索能力和空间记忆能力，且吸入4 h对认知功能影响显著。水迷宫实验是用于评估啮齿类动物空间学习记忆功能的方法，其中包括定位航行实验和空间探索实验，定位航行实验主要用于检测学习和记忆存储能力，空间探索主要用于检测学习和记忆提取能力。本研究结果显示，麻醉后1 d，与对照组比较，七氟醚组目标象限持续时间、目标象限路程缩短，原平台所在象限时间占总时间比、原平台所在象限路程占总路程比下降，提示吸入3%七氟醚麻醉均可引起成年大鼠认知功能下降；其中吸入七氟醚5 h较吸入七氟醚1、3 h大鼠的目标象限持续时间、目标象限路程缩短，原平台所在象限时间占总时间比、原平台所在象限路程占总路程比下降，提示吸入3%七氟醚麻醉5 h使大鼠认知功能下降更加显著，这种影响可能具有时间相关性。

研究显示，吸入异氟醚、七氟醚麻醉可损害认知功能，麻醉后1周较为显著，且这种损害作用可持续数周[5，9，10]。另有研究发现，七氟醚麻醉后24 h未观察到药物残余效应，且吸入麻醉药导致认知功能减退主要发生在第1周，1周后行水迷宫实验发现吸入麻醉组大鼠较对照组大鼠的逃避潜伏期延长[9～11]。因此本研究于麻醉后1 d和7 d对大鼠进行行为学测试。本研究结果显示，麻醉后7 d，与对照组比较，七氟醚组目标象限持续时间、目标象限路程缩短，原平台所在象限时间占总时间比、原平台所在象限路程占总路程比下降，提示吸入3%七氟醚麻醉均可引起成年大鼠认知功能下降，且这种影响持续至少1周。

研究显示，吸入七氟醚麻醉影响认知功能可能与神经递质和受体、长时程增强、细胞毒性作用以及神经凋亡等相关[12]，参与认知功能损害甚至导致认知功能障碍的发生机制甚多。脑内神经递质主要包括烟碱型乙酰胆碱能受体、去甲肾上腺素能受体、谷氨酸等。乙酰胆碱作为脑内广泛分布的重要神经递质，与学习记忆的关系极为密切。α7-nAchR是脑内分布最多的两型受体之一，前期我们已观察了吸入3%、5%七氟醚麻醉会损伤大鼠认知功能与α7-nAchR表达下调参与中枢神经炎症的发生有关，且呈浓度依赖性。有研究报道，吸入七氟醚麻醉可促进Aβ生成[13]，患者脑内Aβ可刺激小胶质细胞的吞噬作用,并诱导TNF-α、IL-1β等炎症因子释放[14]。TNF-α通过激活肿瘤坏死因子受体-1诱导细胞凋亡；IL-1β通过增加p75神经营养因子受体和神经死亡因子表达，促进神经生长因子前体合成，诱导神经元凋亡[15]；从而损害认知功能。α7-nAchR表达下调在突触前膜抑制受体依赖的钙活化和Ach释放，在突触后膜使受体不能接受Ach的兴奋而导致认知功能损害。在背外侧前额叶皮层，α7-nAchR激活可增加含NR2B亚基的NMDA受体离子通道的开放[16]，位于细胞膜的NMDA受体在突触长时程增强过程中起重要作用[17]。α7-nAchR表达下调，含NR2B亚基的NMDA受体离子通道的开放减少，从而引起认知功能损害。本研究结果显示，与对照组比较，七氟醚组麻醉后1 d和7 d脑内α7-nAchR表达均下调，提示吸入不同时间七氟醚对大鼠造成认知功能损害与α7-nAchR表达下调有关，且这种影响可以持续到麻醉后7 d。七氟醚组麻醉后1 d和7 d脑内α7-nAchR表达呈下降趋势，但组间比较无统计学差异，提示α7-nAchR表达无时间相关性，这与水迷宫结果存在差异。推测引起这种结果的原因可能与实验动物的样本量较少、观察时间较短有关。

综上所述，吸入3%七氟醚麻醉1、3、5 h均可导致大鼠认知功能减退，麻醉5 h导致的认知功能减退更明显；这种影响可能与α7-nAchR的表达下调有关。