东北黑蜂的抗寒机制研究

陈孝梅 庞倩 王康 张文文 范荣莉 高夫超 陶靓 周绍春 殷玲 陈国宏 吉挺

（1 扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009；2 黑龙江省农业科学院牡丹江分院，牡丹江 157041；3 黑龙江省野生动物研究所，哈尔滨 150040；4 江苏农牧科技职业学院，泰州 225300）

1 前言

研究表明，蜜蜂在越冬期间会通过减少体内自由水含量、积累抗寒物质等方式来增强其耐寒能力[2]。虫体水分含量的降低可能会诱导抗冻物质的合成[3,4]，也就是说虫体内自由水含量越低，合成的抗冻物质越多，抗寒能力越强。蜜蜂在越冬期间会通过减少体内自由水含量，积累抗寒物质等方式来适应寒冷环境，增强其耐寒能力[2]。还有研究发现，虫体内结合脂肪含量越高，抗寒能力越强[5]。在越冬期昆虫体内有一部分游离脂肪会转化为结合脂肪，结合脂肪会被当作抗寒物质储存起来，用来抵抗严寒的气候。含水量低的越冬蜂王比含水量多的处女王的耐寒能力强[6]，卡尼鄂拉蜂越冬蜂的耐寒性受蜜蜂体内游离脂肪含量的影响，蜜蜂的过冷却能力随着体内游离脂肪含量的增加而增强[7]。所以，蜜蜂体内的自由水含量和游离脂肪含量影响并反映着其抗寒能力。

本研究对东北黑蜂和东北地区的意大利蜂体内的自由水含量和游离脂肪含量进行测定，并结合抗寒相关基因实时荧光定量PCR分析初探蜜蜂的抗寒性能，为今后深入研究蜜蜂的抗寒性能提供理论基础。

2 材料与方法

2.1 样品采集

在吉林省国家基因库采集东北黑蜂和东北地区的意大利蜂，2个蜂种各采集3群蜂，每群3个重复，每个重复10只工蜂。

2.2 主要试剂

氯仿（分析纯）、甲醇（分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司；Trizol（Invitrogen公司），氯仿，异丙醇，乙醇，DEPC水，FastQuant RT Kit（with gDNase）FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（KR106），AceQ qPCR SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒（Vazyme），无酶水。

表1 目的基因信息及引物序列

2.3 主要仪器

50ml离心管，培养皿（φ=8cm），100ml量筒，研杵，分析天平，烘箱，超低温冰箱，低温高速离心机；低温高速离心机，PCR仪（Eppendorf），荧光定量PCR仪（Thermos fisher scientific）。

2.4 试验步骤

2.4.1 自由水含量和游离脂肪含量测定

① 将样品4℃固定后，测定样品的鲜重（FM），然后放入60℃鼓风干燥箱中干燥48h；

② 测定干燥后的样品干重（DM），则自由水含量=（FM-DM）/FM×100%；

③ 取干燥后的单只样品于玻璃匀浆器中，加入3ml氯仿和甲醇提取液（氯仿∶甲醇=2∶1），充分研磨成匀浆；

注射降植烷6个月后，取造模成功的小鼠40只，随机分为模型组、阳性对照组（泼尼松，5 mg/kg）和环孢素高、低剂量组（30、10 mg/kg），每组10只。根据预实验结果，阳性对照组和环孢素各剂量组小鼠灌胃相应剂量的药物，每天1次，每周5次（固定在周一至周五早上9点给药），连续18周；模型组和正常对照组小鼠同法给予等体积生理盐水。实验过程中，除模型组小鼠死亡4只、环孢素低剂量组小鼠死亡1只外，其余组小鼠均全部存活。记录实验过程中小鼠体质量变化情况。

④ 将匀浆液转移至5ml离心管中，离心（4500r，10min）；

⑤ 弃上清，向沉淀中加入3ml氯仿和甲醇提取液（氯仿∶甲醇=2∶1），离心（4500r，10min）；

⑥ 弃上清，将沉淀于60℃鼓风干燥箱中干燥至恒重（LDM），则游离脂肪含量=(DM-LDM)/DM×100%。

2.4.2 抗寒相关基因实时荧光定量PCR分析

采集东北黑蜂、东北地区的意大利蜂，分别采集其工蜂的头胸部提取RNA，根据FastQuant RT Kit（with gDNase）FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（KR106）操作说明书将RNA反转录成cDNA。再根据AceQ qPCR SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒（Vazyme）的使用说明书进行操作，配制20μl qPCR反应体系：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10.0μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，ROX Reference Dye 2 0.4μl，模板DNA 2.0μl，灭菌蒸馏水6.8μl。qPCR的反应程序是首先进行95℃预变性5min，然后是循环反应阶段，即95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环，最后是构建融解曲线，即进行“95℃15s，60℃ 60s，95℃ 15s”的反应。利用2-ΔΔCt的方法计算基因的相对表达量，利用SPSS软件进行数据分析，用ANOVA的LSD法进行显著性分析，以0.05为显著性水平。参考前人的研究[8,9]选择2个主要目的基因，然后根据荧光定量引物的设计原则，通过NCBI的Pick Primers分析程序在线设计目的基因的引物序列，目的基因信息及引物序列见表1。

3 结果与分析

3.1 自由水含量和游离脂肪含量测定结果

由图1可以看出，东北黑蜂的自由水含量与东北地区意大利蜂的自由水含量无显著性差异，东北黑蜂的游离脂肪含量与东北地区意大利蜂的游离脂肪含量也无显著性差异，说明这2个蜂种的自由水含量和游离脂肪含量不存在差异。

图1 自由水含量和游离脂肪含量测定结果

3.2 抗寒相关基因实时荧光定量PCR分析结果

根据前人的研究结果，筛选了Hsc70-4和HSP602个主要目的基因进行荧光定量PCR分析，RNA分别提取自东北黑蜂、东北地区的意大利蜂工蜂的头胸部。结果显示，东北黑蜂HSP 60和Hsc70-4基因的表达量与东北地区的意大利蜂差异不显著（P＞0.05）（图2）。

图2 抗寒相关基因实时荧光定量PCR分析结果

4 讨论

4.1 自由水含量和游离脂肪含量测定

东北黑蜂和东北地区意大利蜂的自由水含量和游离脂肪含量均不存在差异，说明东北黑蜂与东北地区的意大利蜂在越冬时，其体内与抗寒有关的自由水含量和游离脂肪含量基本一致，也就是说这2个蜂种在应对冷胁迫时具有相似的抗寒机制。因此推测长期生活在东北地区的意大利蜂为适应低温环境也形成了一定的抗寒能力，说明意大利蜂也是有抗寒潜质的，体现了蜜蜂对低温环境的适应性，其抗寒性能可能受到环境的影响。

4.2 抗寒相关基因实时荧光定量PCR分析

为进一步探究蜜蜂与抗寒相关基因表达量的差异，本研究对东北黑蜂和东北地区的意大利蜂的2个抗寒相关基因进行实时荧光定量PCR分析。结果表明，东北黑蜂HSP60和Hsc70-4基因的表达量与东北地区的意大利蜂差异不显著（P＞0.05）。热激蛋白（HSPs）又称热休克蛋白，是生物体受到不良刺激或应激条件下产生的一种蛋白质，按照分子量大小，HSPs分为大分子HSP（100～110kD）、HSP90（83～90kD）、HSP70（66～78kD）、HSP60以及小HSP（sHSP，12～34kD）5个家族，HSP70又包括hsc70-1、hsc70-2、hsc70-3、hsc70-4和hsc70-55个组成性成员。研究表明，当机体受到冷胁迫或热胁迫时，体内热激蛋白的表达量会明显升高[10]。研究显示，HSP70对果蝇的寿命具有一定的影响[11,12]，其高表达能够延长变异线虫的寿命[13]，而拥有较长的寿命是越冬蜂的重要特点。东北黑蜂HSP60和Hsc70-4基因的表达量与东北地区的意大利蜂差异不显著，说明在应对冷胁迫时，蜜蜂体内相关抗寒基因的表达量无明显差异，猜测可能是因为东北地区的意大利蜂因长期生活在寒冷的东北地区，对低温环境产生了适应性，形成了一定的抗寒能力，因此初步认为蜜蜂的抗寒能力可能受环境影响，东北黑蜂的抗寒性可能是其对低温环境的一种适应性。

5 结论

本研究通过测定自由水含量和游离脂肪含量以及荧光定量PCR分析，结果表明，东北黑蜂的自由水含量与东北地区意大利蜂的自由水含量和游离脂肪含量均无显著性差异（P＞0.05）；抗寒相关基因实时荧光定量PCR分析结果表明，东北黑蜂HSP60和Hsc70-4基因的表达量与东北地区的意大利蜂差异不显著（P＞0.05）。说明长期生存在东北地区的意大利蜂也形成了一定的抗寒能力，推测东北黑蜂的抗寒性是其对环境的一种适应性，蜜蜂的抗寒能力可能受环境影响。