细胞黏附分子1在子宫内膜异位症患者中的表达差异

麦艳芬，钱怀萍，胡淑娟，陈仰新，麦雪鹂

(广东省佛山市第五人民医院，广东 佛山 528211)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs) 简称内异症，是指子宫内膜组织(腺体和间质)在子宫腔被覆内膜及子宫以外的部位出现、生长、浸润，导致反复出血，继而引发疼痛、不孕及结节或包块等病变的疾病[1]。内异症是生育年龄妇女的多发病、常见病，具有明显的激素依赖性。据统计，在育龄期女性中内异症的发病率为2%～10%，其中约30%合并有严重痛经，30%～50%合并不孕症，严重地影响着患者的身体健康和生活质量。内异症是具有恶性疾病表现的良性疾病，其治疗的难点在于其病变广泛、形态多样、具有侵袭性和复发性。内异症早期症状不明显，较小、散在及深部的病灶难以通过影像学检查及时发现，多数患者在症状加重后才依靠术中镜检及术后活检确诊。

细胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CADM1)的表达缺失已经被证实与多种恶性肿瘤的转移性生长密切相关[2-4]。内异症虽为良性病变，但表现出一定的转移和浸润性生长的特点，与恶性肿瘤的生物学行为类似。本研究假设CADM1表达缺失在内异症患者在位内膜脱落、转移的过程中同样起到促进作用，并最终导致异位内膜的形成。因此，拟通过从细胞、蛋白质表达的层面测定CADM1在异内膜、在位内膜和正常内膜中表达水平的差异。对上述假设进行验证，具体试验方法及结果如下。

1资料与方法

1.1一般资料

受试者收集自2016年9月至2017年6月间在佛山市第五人民医院妇科，因痛经、慢性腹痛、不孕症就诊的患者共59例。所有患者接受腹腔镜下取可疑病灶活检，并经病理科行病理检查确诊为子宫内膜异位症。患者年龄19～46岁，平均年龄31.60±5.70岁，病程0.5～6.1年，平均病程3.20±4.70年，平均月经周期26.40±5.80天，平均经期5.30±1.10天。严格按照纳入排除标准进行筛选，最终入组子宫内膜异位症患者20例。20例异位内膜、20例在位内膜均取自入组的受试者。异位内膜通过腹腔镜取得，在位内膜通过宫腔镜或手术取得；20例正常内膜来自因不孕症行诊断性刮宫所收取的正常子宫内膜及因宫颈上皮内瘤变Ⅲ期(简称CINⅢ)行子宫全切术的患者。内异症患者的内膜和正常内膜均在分泌期取材。所取得的所有内膜组织均经佛山市第五人民医院病理科行病理诊断明确组织来源及性质。

1.2纳入及排除标准

1.2.1纳入标准

包括：①经本院病理诊断为子宫内膜异位症；②病情符合美国生殖医学学会(American Society for Reproductive Medicine，ASRM)分期Ⅱ～Ⅳ期；③病灶位于腹腔或盆腔，易于使用腹腔镜进行取材，且取得组织足够进行后续试验所需；④年龄18至40岁(包括18及40岁)；⑤自愿参加本临床试验，签署知情同意书。

1.2.2排除标准

包括：①月经周期不规律；②患有妇科恶性疾病，盆腔炎性疾病；③合并有其它恶性疾病；④在1个月内服用了性激素类药物、芳香化酶抑制剂、达那唑；⑤其它可能干扰实验结果的特殊情况。

1.3试验方法

1.3.1 CADM1阳性细胞率的测定

内膜组织细胞中CADM1阳性的比率采用免疫组化染色法进行测定。将取得的内膜组织用石蜡包埋制成4μm切片，然后经过脱蜡、抗原修复、过氧化物酶阻断、血清封闭制成备用切片。CADM1一抗单克隆抗体，生物素标记的二抗，DAB显色，然后进一步复染、脱水、透明、封片。细胞浆染成棕黄或者棕褐色颗粒视为阳性。采用光学显微镜进行观察，先在低倍视野下选取染色最深部位，再在高倍视野下选3个视野数阳性细胞数，阳性细胞率=阳性细胞/总细胞数×100%，所有样本计算阳性细胞率，并计算平均值。

1.3.2 CADM1蛋白的测定

内膜组织中CADM1蛋白的表达水平采用Western blotting法进行测定。采用细胞裂解液提取组织总蛋白，取相同质量的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，然后将凝胶上的蛋白转印至NC膜上，用5%BSA室温封闭2h，加入一抗(CADM1，1:600；GAPDH，1:1 000)4℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1:1 000)室温孵育12h。将NC膜置于ECL中反应1～3 min，曝光、定影。使用Quantity One分析软件对Western blotting条带进行定量。以目的蛋白测定值与GAPDH的比值作为目标蛋白的相对表达量。

1.4统计学方法

2结果

2.1免疫组化染色结果

通过免疫组化结果可知，异位内膜组织中CADM1染色的细胞阳性表达最低，在位内膜组织中CADM1染色的细胞阳性表达次之，而正常内膜中CADM1细胞阳性表达最高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。

注:a为正常内膜，b为在位内膜，c为异位内膜。

表1 内膜组织中细胞染色阳性表达

2.2 Western Blotting结果

内膜组织中CADM1蛋白相对表达量在异位内膜中最低，在位内膜中次之,正常内膜中最高。具体见表2、图2。

表2 内膜组织中CADM1蛋白相对表达量

图2不同内膜组织中CADM1的蛋白表达

Fig.2 Protein expression of CADM1 in different endometrial tissues

3讨论

3.1子宫内膜异位症的发病机制

子宫内膜异位症虽然在病理组织学定性为良性病变，但其生物学行为具有增生、浸润、转移、易复发等类似恶性肿瘤的特点，又被称为“良性癌症”[5]。特殊的生理特性导致内异症迁延难愈，研究者们一直尝试对内异症的特殊生物学表现作出解释，但目前仍未达成共识。早期学术界对于内异症病灶的来源主要有两种认识，一种认为其来自于宫内内膜的脱落转移，包括经血逆流转移和淋巴管、静脉播散两种学说；另一种认为异位内膜由腹腔及其他发病部位具有分化潜能的细胞转化而来，即体腔上皮化生学说。此外，较新的研究还提出了诱导学说、胚胎残留学说、遗传、激素、细胞免疫改变等思路。

目前对于内异症发病机理认可度较高的是我国著名妇科学者郎景和教授提出的“在位内膜决定论”，认为在位内膜的特性决定了内膜碎片能够在异地种植，在位内膜的差异是内异症发病的决定因素，正常内膜保有化生的潜能，在由于遗传、免疫、环境、激素的综合作用下，这种潜能被激活并在基因活化、转录、蛋白表达等途径中发生了一系列与恶性肿瘤相类似的改变，细胞最终获得转移、侵袭、增殖、诱导血管生成等能力，发展成为内异症。

3.2子宫内膜异位症的生物标志物

子宫内膜异位症的生物标志物研究对于早期诊断子宫内膜异位症具有重要的临床意义，特别是对于早期超声没有明显可见的卵巢子宫内膜异位，盆腔粘连或其他盆腔病变的患者。癌症抗原125(cancer antigen 125，CA 125)是子宫内膜异位症最广泛使用的外周生物标志物，但是外周血中的CA125水平作为子宫内膜异位症的单一生物标志物敏感性低。膜联蛋白V(annexin V)，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和可溶性细胞间黏附分子-1(soluble inter-cellular adhesion molecule-1，sICAM-1)是子宫内膜异位症的生物标志物[6]，由于缺乏大样本的数据，其特异性只有60%～80%[7]。另外一种研究较为广泛的是Glycodelin蛋白，研究证明，Glycodelin是一种具有已知血管生成，免疫抑制和避孕作用的子宫内膜来源蛋白，可能促进子宫内膜异位症和子宫内膜异位症相关不孕的发生。 此外，Glycodelin不仅产生于分泌性子宫内膜的腺上皮，而且还从子宫内膜异位病灶脱落至腹膜液和血清中。在子宫内膜异位症患者中观察到血浆Glycodelin水平升高[8]。随着技术的进步和研究的不断发展，越累越多灵敏性高，特异性高的子宫内膜异位症生物标志物被发现。

3.3子宫内膜异位症与CADM1

CADM1属于细胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成员，属于抑癌基因的一种。CADM1通过参与细胞递质(细胞黏附分子)的生成影响细胞骨架的构建，维持细胞相互黏附的稳定性，此外具有抑制细胞过度增殖的作用[9]。CADM1最先被证实对肺癌具有抑制作用，随后在结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤等恶性疾病中都发现了CADM1的低表达，且其表达程度与恶性肿瘤的分化程度和转移能力呈负相关，当CADM1表达失活时或受到抑制时，细胞间黏附力下降，易于恶性细胞的脱落和转移，说明了CADM1的表达降低是恶性肿瘤转移的一个重要环节[10]。在本试验中，内异症患者异位内膜、在位内膜在细胞层面、蛋白表达量方面均表现出CADM1低表达，与正常内膜组之间具有明显的差异(P<0.05)。由此可以认为虽然在位内膜的生理结构和分布位置仍然在正常内膜的范围，但是分子表达已经发生异常转变。普遍存在的CADM1的低表达可能导致非经期的异位内膜组织或细胞脱落，随即经输卵管或血道、淋巴道转移、种植至其他部位。异位内膜同样表现出CDAM1低表达，可能与其来源于在为内膜，继续表达原组织的分子学特性相关。本试验的研究结果为“在位内膜决定论”提供了新的依据，一定程度上揭示了转移的发生内在机理，而且证明了在位内膜和异内膜之间的关系。

目前，将CADM1已经有望成为新的肿瘤标志物[11]。而本研究的结果初步证实了CADM1在内异症转移性种植的过程中可能起到了与在恶性肿瘤中类似的作用，可能为内异症的早期诊断和治疗提供新的思路。