冀谷34中自噬相关基因SiATG5的克隆及响应干旱胁迫机理研究

王根平，刘敏轩，2，张 婷，师志刚，张喜瑞，杨伟红，李 琳，高 翔，董 立，程汝宏*

（1.河北省农林科学院谷子研究所，国家谷子改良中心，河北省杂粮研究实验室，河北 石家庄 050035；2.中国农业科学院作物科学研究所，国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程，北京 100081）

自噬是真核生物在生长过程中抵御各种环境胁迫时细胞内一种进化保守的物质代谢降解过程。在逆境胁迫下，细胞通过自噬将胞内多余的蛋白质或受损细胞器进行降解并加以循环利用，从而维持细胞稳定和应答环境胁迫[1，2]。细胞自噬形式主要有巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬3种[3]。在植物中研究最多的是巨自噬[4]。巨自噬首先包被降解物于双层膜结构的自噬小体（Autophagosome）中，通过自噬小体外膜与液泡膜的融合将包裹物质送入液泡腔并完成降解，从而应对饥饿或逆境胁迫下营养物质的不足[3]。

自噬需要自噬相关基因（Autophagy-related genes，ATG）编码蛋白的参与。ATG最先在酵母中发现[5]，得益于酵母上的工作，目前在拟南芥[6，7]、烟草[8]、水稻[9]、玉米[10]和谷子[11]等植物中也发现了ATG同源基因。不同植物中已报道的ATG数量有30个左右，分布于基因组的不同位置。ATG蛋白参与细胞代谢和生长发育的多个进程，如细胞程序性死亡、衰老、营养缺乏、液泡形成、逆境胁迫等[5-7]。在正常条件下，ATG处于低水平表达；在逆境胁迫，如饥饿、干旱、高盐、氧化胁迫、病毒侵染等诱导下，其表达量升高[12]。如，谷子ATG8响应低氮诱导，在氮源匮乏的条件下表达量升高[11，13]；烟草ATG6同源基因BECLIN1可以促使病毒感染位点细胞的死亡，从而阻止病毒向未侵染部分扩张[14]；水稻OsATG7-1突变体植株出现生物量和氮利用率降低的缺陷；玉米ATG12突变体植株出现叶片衰老加速和穗发育畸形的表型[10]。

研究表明，ATG5在自噬体形成和逆境胁迫中起着重要作用。Romain等发现，拟南芥ATG5蛋白是自噬体形成的关键蛋白，在ATG5突变体植株中不能形成自噬体[15]；另外，拟南芥ATG5突变体植株在低氮和避光条件下出现叶片失绿变黄、叶斑增加、叶片衰老加速等表型特征，而ATG5正常植株可以存活较长时间[16，17]。然而，有关ATG5对干旱响应的作用机理研究报道较少。因此，研究ATG5在干旱胁迫下的表达模式，对阐释ATG5在抗旱中的功能作用具有重要意义。

谷子是我国北方重要的粮食作物之一，具有抗旱、耐瘠等特点。Li等[11]在全基因组水平上分析了谷子中ATG相关基因，共发现37个基因，其中有26个基因与抗旱相关，包括SiATG1、SiATG2等。以河北省农林科学院谷子研究所育种研究室培育的优质抗旱、兼抗阿特拉津和拿捕净除草剂谷子品种冀谷34为试材，分析其ATG5结构及编码蛋白特点，研究不同干旱处理条件下ATG5在冀谷34中的表达模式，旨为探索谷子SiATG5在响应干旱胁迫中的作用以及冀谷34的抗旱机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

谷子试材为河北省农林科学院谷子研究所育种研究室培育的优质抗旱、兼抗阿特拉津和拿捕净除草剂品种冀谷34，其田间抗旱性为1级。

1.2 试验方法

1.2.1 基因克隆和序列分析 根据SiATG5登录号XP_004952117，在Phytozome谷子基因组数据库中搜索，获得参考基因组SiATG5 DNA序列。以此序列为模板，用Primer 5.0软件设计引物F1/R1（表1）。分别以冀谷34 DNA和干旱胁迫处理后的cDNA为模板，用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase（大连宝生物）进行扩增。PCR反应体系为50μL：含5×PCR Buffer 10μL、0.25 mmol/L dNTP 4μL、10μmol/L引物各1μL、Prime SRAR HS DNA聚合酶0.5μL、模板1μL，ddH2O补齐至50μL。PCR反应条件：98益热激活5 s；98益变性10 s，59益退火30 s，72益延伸1.5 min，38个循环；72益保温10 min。采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收大小约1 400 bp的目的条带，回收产物与pEASY-Blunt Zero载体连接（北京全式金）后，转化Trans-T1感受态细胞，挑取菌落送至上海生工生物工程股份有限公司测序，阳性克隆菌液加甘油后-80益保存。总RNA提取参照TransZol Up Plus RNA Kit（全式金）试剂盒说明书进行；cDNA第一链合成按照NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（近岸蛋白科技有限公司）说明书步骤进行；叶片DNA提取参照植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）说明书进行。

利用DNAMAN软件进行DNA和cDNA序列比对，NCBI ORF Finder分析开放阅读框（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），PredictProtein （http：//www.predictprotein.org/）分析二级结构，利用MEGA5.0软件进行系统进化树构建。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1.2.2 干旱胁迫处理 胁迫处理于2017年8月在河北农林科学院谷子研究所实验室进行。在装有细沙-土混合物（事先已灭菌）的花盆（6 cm×12 cm）中播种谷子，然后置于人工气候箱中，在16 h光/8 h暗、30益白天/26益夜间、相对湿度65% 条件下进行培养。待谷子幼苗长至4-5片叶时，移至1/2 Hoagland营养液（pH值5.8）中培养；2 d后，选择长势一致的幼苗，分别移至PEG-6000浓度0（不含PEG-6000）、6% （轻度干旱）、18% （中度干旱）和30% （重度干旱）的1/2 Hoagland营养液中进行干旱胁迫处理[18]。分别在处理后6、12、24 h取叶片，置于液氮中冷冻后在-80益冰箱中保存，备用。每个处理均3次生物学重复。

1.2.3 qRT-PCR 参照SYBR Premix Ex Taq II荧光定量试剂盒说明书（TaKaRa）进行。以谷子Actin（Genbank：AF288226.1）作为内参基因，SiATG5和内参基因的qRT-PCR引物参考Li等[11]文献，分别为F2/R2和F3/R3（表 1）。qRT-PCR在ABI StepOne Plus Real-Time PCR System上进行。每个处理均3次生物学重复，每个生物学重复均3次qRT-PCR重复。根据扩增曲线确定每个反应的Ct，以Actin为内参校正PCR模板的拷贝数。相对表达量采用2-驻驻Ct方法计算[19]。

2 结果与分析

2.1 SiATG5的克隆及序列分析

分别以抗旱品种冀谷34 DNA和6% PEG-6000干旱胁迫12 h后的cDNA为模板，扩增获得SiATG5gDNA和cDNA全长序列。测序结果表明二者序列一致，说明SiATG5无内含子。序列分析表明，SiATG5ORF（open reading frame）全长1 092 bp，编码363个氨基酸 （图 1）。

图1 SiATG5氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequences of SiATG5

预测分子量为40.3 kD，理论等电点为5.03，平均疏水性-0.312。二级结构预测结果表明，SiATG5蛋白二级结构中琢-螺旋占34% ，茁-链占12% ，延伸链占17% ，无规则卷曲占37% ，其中含有跨膜螺旋4% （www.predictprotein.org）。YLoc在线软件预测该蛋白位于细胞质。酵母ATG5蛋白与自噬体形成有关，自噬体位于胞质中，与SiATG5蛋白预测定位结果[20]一致。蛋白序列保守结构域分析表明，SiATG5第77-331含有APG5结构域（Pfam：PF04106），为植物和动物ATG5特有结构域。以人ATG12-ATG5复合物晶体结构（PDB ID：c4gdkB）为模板，预测SiATG5蛋白三维结构，有效预测范围为SiATG5的262个氨基酸残基，置信度100% ，覆盖72% 序列。预测SiATG5蛋白三维结构（图2）含有7个螺旋结构，7个茁片。

图2 SiATG5蛋白的三维结构Fig.2 The predicted protein structure of SiATG5

2.2 SiATG5蛋白同源性比较

为了比较SiATG5与其他作物的同源性高低，与单子叶植物、双子叶植物、哺乳动物和酵母中ATG5蛋白序列构建进化树，10个物种共聚为4类，分别是单子叶植物、双子叶植物、哺乳动物和酵母（图2）。其中，SiATG5与高粱和玉米的同源性最高，其次是水稻和小麦，与双子叶植物的同源性较低。

图3 ATG5蛋白进化分析Fig.3 Evolutionary analysis of ATG5 in foxtail millet

2.3 PEG干旱胁迫下SiATG5表达模式分析

图4 不同干旱胁迫下SiATG5在冀谷34中的表达水平Fig.4 The express level of SiATG5 in Jigu 34 under different drought stress

采用PEG-6000模拟干旱胁迫，设置轻度、中度、重度3个干旱胁迫条件，分析胁迫处理后0 h、6 h、12 h和24 h的SiATG5表达量变化情况。结果（图4）表明，在干旱胁迫处理下，SiATG5的表达量均较对照升高。在轻度和中度干旱胁迫条件下，随着胁迫时间的延长，SiATG5的表达量均逐渐升高，其中，轻度干旱胁迫6 h、12 h、24 h的表达量分别较对照提高了0.41倍、0.80倍和1.14倍，中度干旱胁迫6 h、12 h、24 h的表达量分别较对照提高了1.75倍、2.10倍和2.15倍。SiATG5表达量在轻度和中度干旱胁迫下随着胁迫时间的延长而逐渐升高，以及中度干旱胁迫6 h的表达量（2.75）大于轻度干旱胁迫24 h的表达量（2.14），中度干旱胁迫下24h内的平均表达量（3.0）显著高于轻度干旱胁迫下的平均表达量（1.78），说明SiATG5参与冀谷34的抗旱反应，该品种通过SiATG5表达量的提高应对不同的干旱胁迫条件。重度干旱胁迫6 h时表达量达到最高值（3.13），并维持到12 h，在24 h时降低，说明重度干旱胁迫时冀谷34通过迅速提高SiATG5表达量来应对干旱胁迫，但存在表达极值。

4 结论与讨论

自噬相关基因在植物应答逆境胁迫过程中起重要作用。ATG5是自噬体形成过程中的一个关键基因，然而谷子SiATG5在抗旱胁迫中的作用及在干旱响应中的功能作用研究较少。Li等[11]利用谷子基因组数据库鉴定了37个谷子ATG相关基因，其中26个基因受干旱、盐胁迫诱导表达，在PEG（6% ）处理1 h和12 h后ATG5表达量均表现升高，说明ATG5与干旱胁迫相关。本研究采用PEG-6000模拟干旱胁迫，分析了轻度、中度、重度干旱胁迫6 h、12 h和24 h的SiATG5表达水平，结果表明，SiATG5在调控冀谷34的抗旱性中起着重要作用。SiATG5表达量与抗旱水平高度相关，随着干旱程度的加重，SiATG5的表达量逐渐升高，说明SiATG5通过其表达水平的变化应对不同程度的干旱胁迫；在轻度干旱胁迫下的最高表达量（2.14）低于中度（3.15）和重度（3.13）干旱胁迫下的表达量，以及中度和重度干旱胁迫下表达量达到最高值的时间点不同，表明轻度和中度干旱对冀谷34影响较小，SiATG5表达量随着胁迫时间的延长而提高，但在重度干旱条件下胁迫处理6 h后其表达量即达到最高值，说明此时已对冀谷34影响较大，SiATG5通过迅速提高其表达量来应对干旱胁迫。

植物抗旱是一个复杂的过程，Romain等[15]研究表明ATG5蛋白具有吞噬泡结构域，蛋白位于自噬体形成部位，是自噬体形成所必须的。ATG5突变体不能形成自噬小体。其作用机理为ATG5通过与ATG12和ATG16形成ATG12-ATG5-ATG16复合体，ATG5复合体能够与位于自噬体膜表面的ATG8结合，从而瞄定ATG8在自噬体上，参与自噬体膜的扩展和自噬体闭合，这些基因是否参与植物的抗旱水平等也需进一步研究。