槐米多糖提取方法比较

吴昌术，朱广双

（芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽芜湖241000）

0 引言

多糖是一种由单糖通过糖苷键聚合而形成大分子聚合物，广泛存在于植物、动物和微生物中。研究发现，多糖具有增强细胞免疫、抑制肿瘤、降血糖、降血脂、抗凝血、抗血栓，抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗辐射、抗菌、消炎、抗病毒等生物活性[1-4]。槐米为豆科植物槐的花蕾，味苦、性微寒，是一种药食两用植物。近代医药研究证实，槐米多糖具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、降血糖、抗凝血等药理作用[5-6]。据文献报道，植物多糖提取方法有多种，但对槐米多糖提取方法研究不多，已报道的有热水提取法和超声波辅助提取法等，未见酶法提取、超声复合酶法提取报道，且这些方法之间缺乏比较。试验以槐米为原料，分别采用纤维素酶法、果胶酶法、复合酶法和超声复合酶法提取槐米多糖，以槐米多糖提取率为评价指标，采用正交试验优化提取条件，并比较各种提取方法，为槐米多糖开发应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：槐米，购于芜湖市张恒春中药房。

试剂：纤维素酶（10×104U/g），山东隆科特酶制剂有限公司提供；果胶酶（10×104U/g），青岛益生堂生物有限公司提供；苯酚、无水乙醇、乙醚、石油醚、丙酮、醋酸、醋酸钠、葡萄糖、浓硫酸，均为分析纯。

1.2 仪器及设备

HH-6型数显恒温水浴锅，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司产品；722型分光光度计，北京瑞利分析仪器有限公司产品；FA11041V型电子分析天平，上海精密仪器有限公司产品；RE-52型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品；KQ3200DE型超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 原料处理

在60℃条件下烘干槐米1 h左右，然后粉碎60目过筛。称取处理后槐米粉200 g，用石油醚回流2次以上，以除去脂类，抽滤，药渣风干，再用80%乙醇回流提取2次，以除去单糖和低聚糖，抽滤，将药渣烘干备用[5，7]。

1.3.2 酶法提取

准确称取上述经脱脂烘干后药渣5 g，料液比1∶30（g∶mL），加入150 mL醋酸-醋酸钠缓冲液，加酶保温一定时间，升温至100℃灭酶活10 min，抽滤浓缩，加无水乙醇使醇体积分数为75%，醇沉过夜，以转速3 000 r/min离心10 min后得沉淀物，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤数次后真空干燥，制得槐米粗多糖。将槐米粗多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL容量瓶中，测定糖含量，计算多糖提取率。

1.3.3 超声复合酶法提取

准确称取经脱脂烘干后药渣5 g，参考文献[8]料液比1∶30（g∶mL），加入150 mL醋酸-醋酸钠缓冲液，加酶保温一定时间，升温至100℃灭酶活10 min，冷却，超声提取一定时间，冷却，按1.3.2从“抽滤”起操作，得到槐米粗多糖。将槐米粗多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL容量瓶中，测定糖含量，计算多糖提取率。

1.3.4 槐米多糖含量测定及得率的计算

槐米多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[9]。精密称取105℃干燥至恒质量葡萄糖100 mg，用蒸馏水溶解并定容于1 000 mL容量瓶中，即得到质量浓度为0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液。用移液管精密吸取葡萄糖标准溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL分别置于10 mL具塞试管中，用蒸馏水补至2 mL。每只试管中分别加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，放置10 min，置恒温水浴锅中沸水加热15 min，取出用流动水冷却至室温，用分光光度计于波长490 nm处测其吸光度。以葡萄糖质量浓度（mg/mL） 为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程为Y=5.936X+0.012 6，R=0.999 2，线性范围为0.01～0.08 mg/mL。

将上述酶法提取、超声酶法提取粗多糖分别用蒸馏水溶解定容至100 mL容量瓶中，然后用移液管精密吸取样品液1 mL置于10 mL具塞试管中，加入蒸馏水1 mL，按上述从“分别加入5%苯酚溶液1.0 mL”起操作，于波长490 nm处测定吸光度，每份样品做3次平行试验，取平均值。

槐米多糖得率计算公式：

式中：C——测定样液中多糖质量浓度，mg/mL；

V——样液总体积，mL；

M——提取所用槐米干粉质量，g。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶法提取槐米多糖正交试验结果

以加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解pH值为影响因素，每个因素设3个水平进行正交试验，按照1.3.2所述工艺流程用纤维素酶法提取槐米多糖，确定各因素对槐米多糖提取率影响，优化提取工艺条件[10-13]。

纤维素酶法正交试验及结果见表1。

表1 纤维素酶法正交试验及结果

从表1极差大小结果可知，影响槐米多糖提取率的因素主次顺序为A＞D＞C＞B，即加酶量＞酶解pH值＞酶解时间＞酶解温度，较优组合是A2B3C2D3，最佳提取条件为纤维素酶加酶量1%，酶解温度65℃，酶解时间60 min，酶解pH值6。采用最佳提取条件提取槐米多糖，多糖提取率为6.10%。

2.2 果胶酶法提取槐米多糖正交试验结果

以加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解pH值为影响因素，每个因素设3个水平进行正交试验，按照1.3.2中所述工艺流程用果胶酶法提取槐米多糖，确定各因素对槐米多糖提取率影响，优化提取工艺条件[11-13]。

果胶酶法正交试验及结果见表2。

从表2极差大小结果可知，影响槐米多糖提取率的因素主次顺序为A＞D＞C＞B，即加酶量＞酶解pH值＞酶解时间＞酶解温度，较优组合是A2B2C2D3，最佳提取条件为果胶酶加酶量1.0%，酶解温度55℃，酶解时间60 min，酶解pH值6。采用最佳提取条件提取槐米多糖，多糖提取率为6.29%。

2.3 复合酶法提取槐米多糖正交试验结果

由表1～表2可知，影响槐米多糖提取率的因素主次顺序均为加酶量＞酶解pH值＞酶解时间＞酶解温度。对试验结果影响较大是加酶量和酶解pH值，而影响最小是酶解温度，即在45～65℃温度范围内对试验结果影响较小，因此酶解温度固定为55℃，以纤维素酶、果胶酶的加酶量、酶解时间、酶解pH值为影响因素，每因素设3个水平进行正交试验，按照1.3.2中所述工艺流程，采用复合酶法提取槐米多糖，确定各因素对槐米多糖提取率影响，优化提取工艺条件。

表2 果胶酶法正交试验及结果

复合酶法正交试验及结果见表3。

表3 复合酶法正交试验及结果

从表3极差大小结果可知，影响槐米多糖提取率的因素主次顺序为B＞A＞D＞C，即果胶酶量＞纤维素酶量＞酶解pH值＞酶解时间，较优组合是A1B2C3D3，最佳提取条件为纤维素酶加酶量0.5%，果胶酶量1.0%，酶解时间80 min，酶解pH值6。采用最佳提取条件提取槐米多糖，多糖提取率为6.54%。

2.4 超声波复合酶法提取槐米多糖正交试验结果

根据2.1～2.3的试验结果，固定纤维素酶加量0.5%，果胶酶加量1%，酶解温度55℃，酶解pH值6，以料液比、酶解时间、超声功率、超声时间为影响因素，每个因素设3个水平进行正交试验，按照1.3.3中所述超声波复合酶提取的工艺流程提取槐米多糖，确定各因素对槐米多糖提取率影响，优化提取工艺条件。

超声波复合酶法正交试验及结果见表4。

表4 超声波复合酶法正交试验及结果

从表4极差大小结果可知，影响槐米多糖提取率的因素主次顺序为B＞C＞A＞D，即酶解时间＞超声时间＞料液比＞超声功率，较优组合是A2B3C3D3，最佳提取条件为料液比1∶30，酶解时间80 min，超声时间40 min，超声功率400 W。采用最佳提取条件提取槐米多糖，多糖提取率为7.42%。

2.5 多糖提取方法比较

根据2.1～2.4试验结果，结合参考文献[5]，比较6种槐米多糖提取方法的最佳提取条件和多糖提取率。

提取方法比较见表5。

表5 提取方法比较

从表5结果可知，热水提取法时间最长，超声波提取法时间最短，2种方法多糖提取率均偏低且无明显差异。2种单一酶法多糖提取率均高于热水提取法和超声波法，以果胶酶法最高。复合酶法提取率稍高于果胶酶法，说明2种酶共同作用并未显著提高多糖提取率。超声复合酶法多糖提取率显著提高，说明超声复合酶法对多糖提取有较大促进作用。

多糖化合物存在于植物细胞壁中，因此用复合酶处理槐米样品，纤维素酶和果胶酶可破坏细胞壁，复合酶联合作用有利于多糖溶出，再结合超声波处理，利用超声的空化作用而使多糖溶出大为增加，因此超声复合酶法是一种高效多糖提取方法。

3 结论

采用纤维素酶法、果胶酶法、复合酶法、超声复合酶法等方法分别提取槐米多糖，以提取率为评价指标，优化了提取条件，对各种提取方法进行了比较。结果表明，与热水提取法和超声波法相比，纤维素酶法、果胶酶法均能提高槐米多糖提取率，时间也大为缩短，其中超声波与复合酶协同作用能显著提高槐米多糖提取率。在最佳提取条件下，槐米多糖提取率分别为纤维素酶法6.10%，果胶酶法6.29%，复合酶法6.54%，超声复合酶法7.42%。