鹅细小病毒基因组结构研究进展

曹 楠 杨舒展 黄冠雄 郭思璇 曾依翎 李冰心 田允波 许丹宁

（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东 广州 510225；3.广东出入境检验检疫局技术中心，广东 广州 510623）

鹅细小病毒（Goose Parvovirus Virus，GPV）可侵染3～20日龄雏鹅和雏番鸭小鹅，造成出血性、纤维素性和渗出性肠炎，是雏鹅和雏番鸭的一种严重传染病［1］。扬州大学的方定一教授于1956年首次发现了GPV并对其做了详细的研究［2］。此后，日本［3］、英国［4］、匈牙利［5］、瑞典［6］、法国［7］和美国［8］等许多国家陆续报道了该病。与此同时，该病在我国福建［9］、江苏［10］、四川［11］、山东［12］等主要的水禽养殖地区广泛流行，给水禽养殖行业造成了严重的经济损失。国内外很多学者都对其展开了研究，经过几十年的不断探索，GPV的分子结构及相应的生物学特点逐渐被研究透彻。

1 鹅细小病毒病原学

GPV属于细小病毒科细小病毒属，病毒粒子呈圆形或六角形，外直径为20～25 nm，内直径约为15 nm，外壳厚约5 nm，可以形成二十面体对称的空间结构［13］。通过X射线衍射发现，GPV病毒粒子每个5重对称轴上均含有一个中空圆柱体，并且有沟槽环绕圆柱体的周围。此外，GPV每个2重对称轴上有一个凹窝，每个3重对称轴上有一个突起，这个突起是病毒对宿主嗜性的决定因素［14］。GPV病毒粒子表面没有囊膜结构，单链线状DNA构成病毒的核酸结构，外部由3种结构蛋白组成病毒的衣壳。感染性GPV颗粒的沉降系数为110 S，而缺少DNA的非感染性GPV粒子则为65 S。GPV对外界环境有着较强抵抗能力，在56℃条件下作用1 h仍然具有活性并可导致鹅胚死亡。由于GPV表面没有囊膜结构，所以乙醚、氯仿等有机溶剂无法对病毒产生作用，并且GPV对胰酶也有抵抗力，但对紫外线较敏感［15］。大多数种类的细小病毒，如犬细小病毒（Canine Parvovirus Virus，CPV）、猫泛白细胞减少症病毒（Feline Panleukopenia Virus，FPV）等具有血凝性，然而GPV却无血凝性［16］。

2 鹅细小病毒分子结构

GPV基因组由单链线状DNA构成，全长为5 kb左右，如图1所示［17］，GPV基因包括2个开放性阅读框，可合成5种基因，分别为VP1、VP2、VP3、NS1和NS2，其基因长度分别为2 199、1 764、1 605、1 884 nt和1 356 nt。病毒基因组5´及3´端还具有重复倒置的回文结构（Inverted Terminal Repeat，ITR），其长度为444 nt，分为头部和“泡区”。GPV的基因组可以编码5种蛋白，分别为3种结构蛋白VP1、VP2、VP3及2种非结构蛋白NS1、NS2，编码蛋白质分子质量分别为88、65、60 ku和77、50 ku左右［18-20］。Viginie［21］通过基因序列对比分析发现，鹅细小病毒与番鸭细小病毒同源性较高，这提示这两种病毒有可能都是从腺联病毒2型演化而来的。

图1 GPV基因组结构

2.1 结构蛋白

GPV的LORF可以编码3种结构蛋白，分别为VP1、VP2、VP3。这3种结构蛋白的起始密码子位点各不相同，但是共用相同终止密码子［22］。GPV的VP基因中有一个P41启动子位于起始密码子前，P41的转录产物经剪接后翻译产生VP1和VP2蛋白。在合成整个核壳后，GPV的VP2蛋白N端剪去部分氨基酸从而形成VP3［23］。通过序列分析发现，GPV有3个阅读框，其中VP1基因包括VP2基因，VP2基因又包括VP3基因。VP1和VP3基因的起始密码子是ATG，但是VP2的起始密码子是非典型的ACG。这些基因编码的VP1蛋白比VP2蛋白N末端多145个氨基酸，比VP3蛋白N末端多198个氨基酸［24］。

根据对不同种类细小病毒结构蛋白的研究发现，VP1、VP2、VP3蛋白参与到病毒感染宿主细胞的过程。VP1蛋白在病毒衣壳蛋白的合成及形成感染性颗粒的过程中起着重要作用。VP1蛋白的N末端含有信号肽序列，可以引导病毒在宿主细胞内的定位；其N末端还有一些磷脂酶序列，可能参与了病毒的感染。细小病毒侵入到宿主细胞后，病毒衣壳通过内吞小体转运至细胞核，VP1蛋白由于低pH值等不良环境暴露出其独特区，暴露出的N端就可指引内吞小体往细胞核转运［25］。如果病毒的VP1蛋白缺失，VP2蛋白也可以折叠组装病毒颗粒，说明VP2参与病毒衣壳的合成以及病毒颗粒的细胞核输出［26-27］。

构成GPV衣壳蛋白的3种结构蛋白均有抗原性，其中VP3蛋白占的比重最大，约为80%［28］。VP3蛋白为抗原决定簇的主要成分，构成鹅细小病毒的保护性抗原［29-30］。研究发现，VP3以多肽的形式暴露于病毒表面，是GPV重要的免疫保护性抗原，可以诱导动物机体产生中和性抗体，在GPV的免疫防制及诊断中具有重要的意义［31］。

由于GPV是无囊膜病毒，其衣壳蛋白表面的凹痕或突起能够识别受体［32］。糖脂、聚糖和糖蛋白可以作为受体帮助鹅细小病毒进入宿主病毒［33］，这意味着衣壳蛋白的任何突变或改变都可能导致病毒无法侵入宿主细胞［34］。之前的研究表明，Adeno-associated Virus-2（AAV-2）的 VP蛋白上有5个氨基酸（Arg-484，Arg-487，Lys-532，Arg-585，Arg-588）是受体结合位点［35-36］。因为鹅细小病毒和AAV-2同属细小病毒，因此，在这些受体结合位点或周边氨基酸的改变可能会改变鹅细小病毒的毒力［37］。其中在VP蛋白489位点氨基酸的改变可能会导致水禽细小病毒从鹅向鸭进行扩散［33］。

2.2 非结构蛋白

非结构蛋白在细小病毒中有着重要的作用。根据研究发现，细小病毒非结构蛋白功能主要有：①参与细小病毒增殖［38］，即人腺病毒相关病毒2型（AAV-2）的NS78蛋白含有高度保守的基序GPTTGK，具有解旋酶活性和与NTP相结合的能力，GPV的NS1蛋白也可能具有这个功能［39］；②对宿主细胞具有毒性作用，即细小病毒的NS1蛋白可导致宿主细胞发生形态变化乃至甚至发生程序性死亡［40］。

细小病毒的NS2蛋白在病毒复制过程中扮演着重要的角色，从而影响感染性病毒颗粒的产生。研究发现，小鼠细小病毒（Minute Virus of Mice，MVM）NS2蛋白可以与核输出蛋白CRM1结合，从而使NS2蛋白出宿主细胞核进而产生病毒颗粒，如果NS2基因发生变异就会影响病毒衣壳蛋白的合成，也会导致病毒不可复制或使病毒颗粒产生的时间延后［41］。研究发现，MVM的NS2蛋白的氨基末端为毒性作用的活性区域，可以辅助NS1蛋白对宿主细胞的毒性作用。

此外，已经有研究证明GPV的非结构蛋白具有抗原性。邢明伟［42］通过原核表达的方式将GPV H1分离株的NS2蛋白表达出来，经Western-blot和Dot-ELISA鉴定，表达的NS2蛋白可与特异性抗体产生中和。

细小病毒的非结构蛋白在病毒的复制和对宿主细胞毒性作用中有着重要的作用，但是GPV非结构蛋白的作用与其他种类细小病毒的非结构蛋白是否具有相同或相似功能依然有待进一步研究。

2.3 末端回文结构（ITR）

细小病毒科中不同种类的病毒可以根据其ITR的特点分为A、B两类：A类细小病毒，如腺关联病毒2型（Adeno-associated Virus-2，AAV2）、人细小病毒B19（Human Parvovirus B19，B19）的基因组两端的ITR的序列相同，是末端倒置重复序列；与之相对应的是，B类细小病毒基因组两端的ITR序列彼此不相关。GPV基因组两端的ITR倒置重复序列相同，并且其形状大小与B19相近，说明GPV属于A类细小病毒［42］。GPV毒株基因组两端的ITR基因长度约为444 nt，但是不同时间和不同地点分离的GPV的ITR长短各不相同。ITR基因组由于其特殊的分子排布，其头部可以折叠形成U形双链发夹结构，该发夹结构中包含160～180 nt的无错配“茎部”与44 nt的“泡区”，形成“箭状”结构。在“泡区”头端有一个构成对称中心的SphⅠ内切酶的酶切位点（GCATGC）。除此之外，还有数量众多的4～10 nt短核苷酸重复序列存在于GPV的ITR基因序列中［39］。

目前，细小病毒基因组中ITR的功能依然并不是很清晰，但是研究认为ITR在细小病毒的复制和组装过程中发挥着作用，在细小病毒DNA复制过程中扮演着重要的角色。曹佐武［43］将AAV2基因组一端的ITR去除发现，AAV2缺失了一个ITR后，其感染能力和病毒包装能力明显降低，说明ITR在细小病毒AAV2的感染力和病毒包装能力中发挥着重要的作用。

3 结语

目前，关于GPV的研究不够深入，大多是针对GPV的序列分析及致病性研究，而针对GPV的序列分析大多局限于其LORF和RORF，对于强弱毒株的差异、受体结合位点、抗原位点、跨宿主位点等方面的研究不够深入。尤其是随着水禽养殖量的不断增加，在保证了有效接种疫苗的情况下，依然有大量的GPV病例发生，这说明GPV毒力株和疫苗株可能已经产生了分子生物学上的差异，而研究人员对这种差异的研究依然较少。GPV的ITR结构被认为可能和病毒毒力有关，低致病力毒株或疫苗株的ITR多较短，但ITR的具体功能还需要进一步的科学验证。关于ITR功能的进一步研究会为GPV基因工程疫苗的研制提供新的研究方向。

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