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黑蒜总酚提取及抗氧化活性研究

2018-07-25王首人李嗣生李宁阳乔旭光迟雪文毕艳红

关键词:黑蒜液料总酚

王首人,李嗣生,李宁阳*,乔旭光,迟雪文,毕艳红

1.山东农业大学食品科学与工程学院,山东 泰安 271018

2.淮阴工学院生命科学与食品工程学院,江苏 淮安 223003

黑蒜又称发酵黑蒜,是用新鲜大蒜,在恒温恒湿发酵箱里发酵60~90 d后制得的大蒜深加工产品,能够保留大蒜部分原有成份,并且黑蒜中的微量元素含量提高,口味酸甜,无大蒜辛辣味[1]。其由日本人1997年发明,并于2007年申请专利。黑蒜具有较强的抗氧化活性,同时还保留了大蒜原有的部分功效成分。黑蒜多酚含量、过氧化氢活性清除能力以及超氧化物歧化酶(SOD)的活性,比新鲜大蒜分别增加了7倍、10倍、13倍[2-4]。黑蒜具有较强的调节免疫功能[5],其对降低丙二醛的含量和提高GSH-Px的活性方面与鲜蒜相比有明显的优势[6]。与鲜蒜相较,黑蒜在加工过程中大蒜的大分子多糖和蛋白质转化为小分子低聚糖和氨基酸,更有利于人体快速地吸收和转化。其微量元素含量较高,诸如锗、硒等和糖蛋白等活性成分对机体免疫能力的提高、延缓衰老、远离亚健康都可以起到较好的缓解作用[7-11],适合便秘、三高(高血脂、高血糖、高血压)以及癌症人群。黑蒜口味酸甜,食后无大蒜原有臭味,不上火,是速效性的保健食品,逐渐受到人们的喜爱。多酚类物质主要具有强抗氧化作用,还有预防心血管疾病、预防老年性病变、防辐射、抗肿瘤、抗病毒等作用,被称为“第七类营养素”。黑蒜中的多酚比鲜蒜高出约5倍,其中的巯基和亲电子基团能够清除氧和自由基的作用。黑蒜中的总酚类物质的抗氧化活性优于维生素C和维生素E,目前对于该类物质改性的研究较多,但改性过程中对本体物质损失较大,与改性前的对比研究较少,缺少定量数据,改性成本与效果之间的关系将是下一步研究的重点[12]。黑蒜抗氧化活性小鼠实验证实,黑蒜可以降低自由基对细胞膜的氧化损伤,提高体内氧化应激反应,提高肝脏组织中SOD以及组织中GSH-Px的活性,起到延缓衰老的作用[13]。

目前植物多酚的提取方法主要有溶剂萃取法、超声波提取和微波辅助提取、超临界萃取和高压快速提取等。纯化方法主要有常规柱色谱、HPLC半制备色谱、高速逆流色谱法等[14]。总之,对天然多酚的研究还处于初级阶段,分离制备多酚的方法将成为下一步研究的重点。

本文通过采用正交实验的方法对超声辅助提取黑蒜中的总酚类物质进行工艺优化,并对鲜蒜和黑蒜中的总酚提取物的体外抗氧化性进行了全面的比较研究,以期为延伸大蒜深加工产业链,为黑蒜保健产品的开发提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验样品

鲜蒜,购于山东莱芜;黑蒜,实验室自制(取新鲜、无虫蛀、蒜皮完整的鲜蒜在温度80℃,湿度75%的恒温恒湿箱内加工大约15 d,制得黑蒜,其水分含量40%左右,颜色黑褐色,味道酸甜)。

1.2 实验试剂

没食子酸、乙酸乙酯,分析纯,天津市永大化学试剂有限公司;95%乙醇,分析纯,天津市凯通化学试剂有限公司;福林酚,分析纯,Solarbio;抗超氧阴离子测试盒、羟自由基测定试剂盒,均购自南京建成生物科技有限公司;DPPH,ABTS试剂盒,均为美国sigma-Aldrich公司。

1.3 实验仪器

KQ300VDV,三频数控超声波清洗器,上海圣科仪器设备有限公司;RE-600AT旋转蒸发器,上海予华仪器设备有限公司;UV-1800紫外可见分光光度计,日本岛津公司;HC2168高速组织捣碎机上海赛康电器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 总酚标准曲线的绘制及总酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu法[12],将标准工作溶液依次按照0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL取样,测定其吸光值,并以此绘制标准曲线。

1.4.2 黑蒜总酚超声辅助提取单因素试验

1.4.2.1 液料比对黑蒜总酚提取率的影响 准确称取2.0 g样品多份,在超声功率100 W条件下,分别以液料比(v/w)为4:1,5:1,6:1,7:1,8:1,9:1在条件为80℃的操作条件下超声提取40 min,测定总酚含量,每组样品做3次平行实验,取平均值。

1.4.2.2 提取温度对黑蒜总酚提取率的影响 准确称取2.0 g样品多份,在条件为超声功率100 W下,以5:1的液料比(v/w)分别在50℃,60℃,70℃,80℃,90℃,100℃下超声辅助提取40 min,测定其总酚含量,每组样品做3次平行实验,取平均值。

1.4.2.3 提取时间对黑蒜总酚提取率的影响 准确称取2.0 g样品多份,在条件为超声功率100 W下,以5:1的液料比(v/w)在80℃的温度条件下依次进行10 min,20 min,30 min,40 min,50 min,60 min,70 min,80 min提取,分别测定其总酚含量,每组样品做3次平行实验,取平均值。

1.4.3 黑蒜总酚超声辅助提取条件优化 选取提取时间、提取温度、液料比作为总酚提取的主要影响因素,设计L9(33)正交实验,筛选出超声辅助提取总酚的最优工艺条件。

1.4.4 体外抗氧化能力测定方法 取等量鲜蒜、黑蒜按照同样的提取方法进行提取总酚,得到鲜蒜、黑蒜待测样品。

1.4.4.1 DPPH自由基清除能力测定 将精确配置的系列浓度梯度的鲜蒜、黑蒜样液分别加入试管中,后向各试管中加入一定量DPPH乙醇溶液,在避光的条件下充分混合,经37℃恒温水浴1 h后,测定其在517 nm处的吸光值,取蒸馏水为空白对照组。

式中:Ab—对照液吸光值;AS—测定样液吸光值。

式中:Ab—对照液吸光值;AS—测定样液吸光值。

式中:Ab—对照液吸光值;AS—测定样液吸光值。

1.5 数据处理方法

以上实验各重复3次,取平均值,运用SPSS 16.0软件对数据进行描述性统计和相关性分析,使用Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 超声辅助提取黑蒜总酚的单因素实验

2.1.2 不同液料比对黑蒜总酚提取量的影响 结果如图1所示,随着液料比的加大,黑蒜总酚提取量也随之上升,这是由于提取溶剂的用量增加,分子热运动增强,溶质和溶剂的接触机会增强、从而增大了溶剂和溶质的接触面积,减小了溶质和溶剂的传质阻力和扩散距离,这样有利用黑蒜总酚的溶出。当液料比高于5:1时,提取曲线呈现下降的趋势,这可能是由于液料比的增加,杂质被溶解,提取效果降低[15],因此最佳的提取液的液料比为4:1到6:1。

2.1.3 提取时间对黑蒜总酚提取量的影响 图2可以看出,在提取时间逐渐增加的过程中,黑蒜的总酚提取量得变化趋势是先上升后下降。原因可能是随着提取时间的延长,黑蒜总酚在长时间的溶剂体系中可能部分会降解,同时也可能会导致黑蒜中的部分杂质溶于提取溶剂,从而使测定样品中黑蒜的总酚含量产生下降的趋势。因此确定黑蒜总酚高效提取时间为30~50 min为宜。

2.1.4 提取温度对黑蒜总酚含量的影响 由图3可以看出,随着提取温度的不断升高,黑蒜总酚的提取量呈现先升高后下降的趋势,图中显示温度在80℃时黑蒜总酚的提取量达到最高。在温度为80℃之前,随着温度的升高,提取体系分子的热运动不断增强,黑蒜总酚不断溶出,提取体系中气泡不断增多,这样可促进提取体系发生汽化;当提取温度高于80℃,提取体系的蒸汽压不断增强,这样可以使体系中的气泡在闭合的过程中加大了缓冲,从而可进一步消弱提取体系的汽化作用[16]。所以,根据分析可确定黑蒜总酚最佳的提取温度为70~90℃。

图1 不同液料比对黑蒜总酚提取量的影响Fig.1 Effect of different liquid and solid ratio on total phenol extraction in black garlic

图2 提取时间对黑蒜总酚提取量的影响Fig.2Effect of extraction time on total phenol extraction in black garlic

图3 提取温度对黑蒜总酚量的影响Fig.3Effect of extraction temperature on total phenol extraction in black garlic

2.2 超声辅助提取黑蒜总酚工艺的优化

通过对黑蒜总酚提取单因素结果的分析,可确定不同液料比、提取温度、提取时间为黑蒜总酚提取的关键决定因素,所以以该三个因素进行正交实验设计,设计三水平三因素实验,正交实验因素水平如表1,所得正交实验分析结果如表2。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 黑蒜总酚乙醇提取正交试验结果Table 2 Result of orthogonal experiment on ethanol extraction of total phenol in black garlic

通过表2分析,选取的三个因素对正交实验的贡献大小是:B>C>A,即提取温度>提取时间>液料比。通过表2的分析数据可得,理论上的最优正交组合为A2B2C3,即液料比为5:1,提取温度为80℃,提取时间为50 min。通过实验结果,我们发现最优组合的A2B2C3的5号实验的黑蒜总酚提取量为最大,所以说理论上的最优正交组合和实际实验最佳提取结果相符,因此可确定黑蒜总酚提取的最佳条件为:液料比为5:1,提取温度为80℃,提取时间为50 min,该条件下提取黑蒜总酚的含量为2306.8µg/g。

2.3 鲜蒜、黑蒜提取液的体外抗氧化能力

2.3.1 DPPH自由基清除能力 图4显示,当样品浓度的逐渐增加时,两种蒜样品的总酚提取物的DPPH自由基清除能力均有所增加,黑蒜上升的幅度较为明显。相同样品浓度下,黑蒜中总酚提取物的DPPH自由基清除能力约为鲜蒜的4~9倍。

2.3.2 ABTS自由基清除能力 溶液会在抗氧化剂与ABTS自由基发生反应后褪色,导致特征吸光度降低。试验证明,吸光度值与抗氧化能力呈负相关。吸光度的值越低,所检测物质的总抗氧化能力也就越强[17]。图5表明,在同等条件下,黑蒜总酚提取物对ABTS自由基清除能力约为鲜蒜的10倍。

图4 鲜蒜与黑蒜总酚提取物对DPPH自由基清除能力比较Fig.4Comparison of scavenging ability of total phenolic extracts from fresh garlic and black garlic on DPPH free radical

图5 鲜蒜与黑蒜总酚提取物对ABTS自由基清除能力比较Fig.5 Comparison of scavenging ability of total phenolic extracts from fresh garlic and black garlic on ABTS free radical

2.3.3 超氧阴离子自由基清除能力 超氧阴离子清除能力也随样品浓度的增加而显著提高。浓度较低时上升幅度较大,在18.1 μg/mL时趋于平缓,这可能与浸出硒元素含量增加缓慢有关[18]。在黑蒜样品浓度为36.2 μg/mL时,对超氧阴离子自由基清除率可达46.8%。将鲜蒜总酚提取物与黑蒜超氧阴离子自由基清除能力对比,由图6可知相同条件下,黑蒜对超氧阴离子的清除能力约为鲜蒜的3倍。

2.3.4 羟自由基清除能力 黑蒜中含有较多自由基清除能力强的生物活性成分,可清除羟基自由基,抑制由亲水基团APPH引起的氧化反应。从图7可以看出,两种样品对·OH清除率的影响为黑蒜总酚提取物>鲜蒜总酚提取物。在质量浓度为14.48 μg/mL时,黑蒜总酚提取物对·OH清除率可达到88.08%,此时其对羟自由基的清除率是鲜蒜的15倍。这可能是因为黑蒜总酚提取物中含有较多的水溶性硒蛋白,可以有效的清除羟自由基[19]。

图6 鲜蒜与黑蒜总酚提取物对超氧阴离子自由基清除能力比较Fig.6 Comparison of scavenging ability of total phenolic extracts from fresh garlic and black garlic on superoxide anion free radical

图7 鲜蒜与黑蒜总酚提取物对羟自由基的清除能力比较Fig.7 Comparison of scavenging ability of total phenolic extracts from fresh garlic and black garlic on hydroxy radical

3 结 论

(1)实验结果表明,在超声功率100 W,提取溶剂为80%乙醇的条件下,影响超声辅助提取黑蒜总酚的主要因素是提取温度,优化得到的工艺条件为提取温度80℃,液料比5:1,提取时间为50 min,在该条件下,有效成分含量达到最高,得到的总酚含量为2306.8µg/g。

(2)通过比较黑蒜和鲜蒜中总酚提取物的体外抗氧化能力,黑蒜总酚提取物的DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子及羟自由基清除能力均高于鲜蒜,因此黑蒜更适于药用和保健品的开发。

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